[發(fā)明專利]膠體金標(biāo)記Hly基因單克隆抗體測(cè)定單核細(xì)胞增生性李斯特菌試劑盒

無(wú)效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201110449180.8
• 申請(qǐng)日: 2011-12-29
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN102539770A
• 公開(kāi)（公告）日: 2012-07-04
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 何鑫;賈芙蓉;黃勝起;趙麗純;何成彥
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 何鑫;賈芙蓉;黃勝起;趙麗純;何成彥
• 主分類號(hào): G01N33/577
• 分類號(hào): G01N33/577;G01N33/531
• 代理公司: 長(zhǎng)春眾益專利商標(biāo)事務(wù)所(普通合伙) 22211
• 代理人: 紀(jì)尚

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于衛(wèi)生學(xué)檢驗(yàn)及醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)技術(shù)領(lǐng)域。?

背景技術(shù)

李斯特菌屬L?isteria分為2個(gè)群，7個(gè)種。第1群包括單核細(xì)胞增生性李斯特菌L.monocytogenes(簡(jiǎn)稱單增李斯特菌)、伊氏李斯特菌L.ivanovii、無(wú)害李斯特菌L.innocua、韋氏李斯特菌L.welshm?ei及塞氏李斯特菌L.seeligeri；第2群為較少見(jiàn)的格氏李斯特菌L.grayi和莫氏李斯特菌L.m?urrayi.其中單增李斯特菌被認(rèn)為是引起動(dòng)物和人類李斯特菌病的主要致病菌.單增李斯特菌(Usteria?monocytogenes，Lm)是一種短小的革蘭陽(yáng)性無(wú)芽胞桿菌，是一種人畜共患病的致病菌，可使人和動(dòng)物患李斯特菌病。研究發(fā)現(xiàn)單增李斯特菌包括致病性、弱致病性和非致病性3種類型.單增李斯特菌能使人畜致病，造成豬、雞等多種畜禽死亡。人感染后則主要表現(xiàn)為腦膜炎、敗血癥和單核細(xì)胞增多。嬰幼兒、懷孕婦女和免疫耐受病人的感染死亡率可高達(dá)20％～30％。單增李斯特菌廣泛存在于自然界中，人們食用的肉、奶、蛋、水產(chǎn)品、蔬菜以及冷凍食品等均有不同程度的污染，世界衛(wèi)生組織(WHO)在關(guān)于單增李斯特菌食物中毒的報(bào)告中指出：4％～8％的水產(chǎn)品、5％～10％的奶及奶制品、15％以上的家禽、30％以上的肉制品及冷凍制品，均被該菌污染.食品中存在的單增李斯特菌對(duì)人類的食品安全存在較大威脅，是冷凍食品中威脅人類健康的主要病原菌之一。在美國(guó)李斯特菌被列為7種主要的食源性致死病菌之一，已經(jīng)被WHO食品安全工作計(jì)劃列為重點(diǎn)檢測(cè)的食源性病菌之一。?

單增李斯特菌是典型的胞內(nèi)寄生菌，可在巨噬細(xì)胞和許多非吞噬細(xì)胞(如內(nèi)皮細(xì)胞、上皮細(xì)胞和肝細(xì)胞)內(nèi)增殖。單增李斯特菌的致病性涉及多個(gè)毒力因子，如溶血素(Listeriolysin?O，簡(jiǎn)稱LLO)、內(nèi)化素、p60蛋白等。LLO是該菌侵染力的重要組成成分，是LM的主要毒力因子。LLO是一種能結(jié)合膽固醇、可被巰基活化的細(xì)胞溶解素，由hly基因編碼的529個(gè)氨基酸組成，其中有25個(gè)氨基酸構(gòu)成的信號(hào)肽序列。LLO能溶解宿主細(xì)胞吞噬泡膜，逃離噬菌體，進(jìn)入胞漿，逃避吞噬體中殺菌物質(zhì)的殺滅；此外還能在感染細(xì)胞內(nèi)誘導(dǎo)信號(hào)傳導(dǎo)和定向免疫應(yīng)答中發(fā)揮重要作用。由于LLO所具有的獨(dú)特生物學(xué)特性，已被用于構(gòu)建各種減毒疫苗或核酸疫苗，且促進(jìn)MHC-I類分子限制性免疫應(yīng)答，增強(qiáng)了保護(hù)性抗原的免疫作用。?

單增李斯特菌為需氧或兼性厭氧菌，生長(zhǎng)溫度為1～45℃，對(duì)不利環(huán)境具有比較強(qiáng)的耐受能力，在4℃冰箱中也可生長(zhǎng)繁殖，在pH5.0～9.0的環(huán)境中，1年后仍可檢出。這使其危害性更進(jìn)一步增大。另外，單增李斯特菌病原體是定居在細(xì)胞內(nèi)的，因此應(yīng)用抗生素治療李斯特菌病的效果不太理想。由李斯特菌引起的疾病及其食源性感染日益引起世界各國(guó)的重視，對(duì)該病原進(jìn)行快速、靈敏、準(zhǔn)確的檢測(cè)是有效防治本病和保證食品衛(wèi)生安全的重要手段。?

本研究旨在克隆和表達(dá)單增李斯特菌的hly基因，研制基于溶血素的診斷用單克隆抗體，以對(duì)單增李斯特菌進(jìn)行檢驗(yàn)分析及制備基因工程疫苗奠定基礎(chǔ)。國(guó)內(nèi)的趙松波等人已經(jīng)原核表達(dá)出溶血素(LLO)，也建立了LLO的間接ELISA檢測(cè)方法，但是該方法在檢測(cè)動(dòng)物血清時(shí)容易出現(xiàn)假陰性。趙松波提出利用LLO單抗建立夾心ELISA可提高檢測(cè)靈敏度，但相關(guān)工作未見(jiàn)報(bào)道。董慧和羅正等人已經(jīng)制備了LLO單抗，但均未用于實(shí)際樣品檢測(cè)。早在1991年就有國(guó)外的學(xué)者用LM培養(yǎng)上清中純化的蛋白免疫小鼠制備單抗，獲得3株能抑制LLO溶血的單抗、1株能抑制LLO與紅細(xì)胞膜結(jié)合的單抗以及2株能抑制與其他細(xì)胞膜結(jié)合的單抗。1999年Erdenlig等人同樣得到了具有抑制LLO溶血作用的單克隆抗體，并用于鑒定所分離的李斯特菌是否為致病菌株。?

經(jīng)典的李斯特菌分離培養(yǎng)和鑒定技術(shù)需要1-2周時(shí)間，人力、物力花費(fèi)大，不適應(yīng)實(shí)際檢驗(yàn)工作的需要。目前，對(duì)產(chǎn)單核李斯特菌快速檢測(cè)方法的研究，絕大部分尚停留在實(shí)驗(yàn)室的研究階段，很大程度局限于ELISA法和PCR法，而免疫膠體金層析為李斯特菌的檢測(cè)具有快速、便捷的優(yōu)點(diǎn)，可廣泛應(yīng)用于醫(yī)院、商檢、衛(wèi)生、安檢，也可用于家庭進(jìn)行簡(jiǎn)易的檢測(cè)。?其良好的特異性，較高的靈敏度，可靠的重現(xiàn)性和穩(wěn)定性，為產(chǎn)單核李斯特菌檢測(cè)提供了一個(gè)更為理想的檢測(cè)方法和思路。羅利新等所用抗體為產(chǎn)單核李斯特菌抗體(O鏈抗原Ⅰ/Ⅱ)，實(shí)驗(yàn)只針對(duì)單一血清型李斯特菌進(jìn)行了研究，而產(chǎn)單核李斯特菌根據(jù)菌體(O)抗原和鞭毛(H)抗原分成13個(gè)血清型，所以實(shí)驗(yàn)針對(duì)李斯特全菌屬不夠完備。?

綜合以上的國(guó)內(nèi)外研究資料可發(fā)現(xiàn)，單增李斯特菌的檢測(cè)方法仍不夠完備，現(xiàn)有的檢測(cè)技術(shù)方法仍存在如下兩個(gè)方面的不足：?