[發(fā)明專利]膠體金標記Hly基因單克隆抗體測定單核細胞增生性李斯特菌試劑盒

無效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201110449180.8
• 申請日: 2011-12-29
• 公開（公告）號: CN102539770A
• 公開（公告）日: 2012-07-04
• 發(fā)明（設計）人: 何鑫;賈芙蓉;黃勝起;趙麗純;何成彥
• 申請（專利權(quán)）人: 何鑫;賈芙蓉;黃勝起;趙麗純;何成彥
• 主分類號: G01N33/577
• 分類號: G01N33/577;G01N33/531
• 代理公司: 長春眾益專利商標事務所(普通合伙) 22211
• 代理人: 紀尚

1.一種膠體金標記Hly基因單克隆抗體測定單增李斯特菌試劑盒，其特征是：

a、引物設計

L.monocytogenes?Hly蛋白基因序列

根據(jù)GenBank中的L.monocytogenes?Hly蛋白基因序列，應用Primer?Premier5.0，DNA?Club和Oligo?6.0設計特異性引物P1和P2，預期擴增長度為1434bp；在NCBI?GENEBANK中找到基因序列后，看選擇的酶切位點，在所要進行PCR的基因序列中是否存在；用Primer?primer5把序列反向互補；在應用Oligo?6.0引物設計時，上下游引物全長輸入；上游引物位點的確定為5’端模板第一個堿基前面的所有堿基的負數(shù)值+1下游引物位點的確定為下游引物-酶切位點-保護性堿基＝A，序列全長-A+1＝下游引物位點；

上游引物

5一‘AAGAggatccAGAGTGAAACCCATG一3’；

下游引物

5一‘GGACctcgagAATTATTCGATTGGATT一3’；

為下一步克隆需要，分別在上、下游引物中引入BamH?Ⅰ和Xho?Ⅰ酶切位點

b、PCR擴增

PCR反應條件為95℃預變性5min，94℃變性1min，53℃退火1min，72℃延伸2min，擴增32個循環(huán)；預期片段大小1?600bp；

c、瓊脂糖凝膠電泳的反應條件

用1.0％瓊脂糖凝膠電泳分析PCR產(chǎn)物，電壓100V，電泳30min；

d、切下目的DNA片段，用凝膠快速純化回收試劑盒回收；將回收純化的PCR產(chǎn)物與pMD18-T進行連接，并pMD18-T載體16℃12小時以上連接；制備感受態(tài)細胞，應用CaCl₂致敏法制備大腸桿菌感受態(tài)，接種JM109菌種，37℃，225rpm12小時振搖培養(yǎng)后，菌液在LB固體培養(yǎng)基上劃線，37℃孵箱過夜培養(yǎng)，篩選單克?。贿x一單菌落接種于5mLLB培養(yǎng)基中，12小時以上培養(yǎng)，培養(yǎng)物按1/100接種于LB培養(yǎng)基中，培養(yǎng)至A₆₀₀達0.45-0.55，用CaCl₂致敏大腸桿菌；

e、應用熱休克轉(zhuǎn)化法，將連接反應液加入100μL感受狀態(tài)的細胞中，再加3μl?DMSO以增加轉(zhuǎn)化效率，冰浴30min后，42℃休克45s，然后迅速冰浴5min，再將轉(zhuǎn)化產(chǎn)物加入LB液體培養(yǎng)基中復蘇30min后，離心收集菌體，將其鋪于含篩選抗生素的LB固體培養(yǎng)基上，37℃恒溫孵箱放置16h后觀察轉(zhuǎn)化效果；

f、SDS裂解法純化試劑盒制備質(zhì)粒；用BamH?Ⅰ和Xho?Ⅰ進行酶切鑒定及PCR鑒定，篩選出陽性重組質(zhì)粒，命名為pGEX-6P-1-Hly；用BamH?Ⅰ和Xho?Ⅰ進行亞克隆，表達載體pGEX-6P-1和重組克隆載體pGEX-6P-1-Hly用BamH?Ⅰ和Xho?Ⅰ切處理，瓊脂糖凝膠電泳，線性表達載體用DNA快速純化回收試劑盒回收，亞克隆片段用擠膠法回收，亞克隆載體與片段用T4DNA連接酶連接，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化JM109感受態(tài)，提取質(zhì)粒，鑒定陽性克隆；

g、蛋白的誘導表達

用pGEX-6P-1重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化BL21受體菌，選擇單克隆接種到5mL?LB培養(yǎng)液里，按傳統(tǒng)方式誘導表達，即37℃，225rpm振蕩培養(yǎng)至A600達0.6-0.8，加IPTG至1mmol/L，對照組不加IPTG，3h后收集細菌；同時接種誘導菌種，提取質(zhì)粒，BamH?Ⅰ和Xho?Ⅰ酶切驗證確含目的片段后，進行測序，測序正確后進行重組蛋白的后續(xù)實驗；

h、SDS-PAGE電泳

將誘導后菌液30mL?11000rpm離心2min，棄上清，收集菌體，向菌體沉淀中加入2×SDS凝膠加樣緩沖液1000μl，煮沸5min后進行SDS-PAGE電泳；

i、從SDS-PAGE電泳凝膠中切下所需條帶，大約用兩天時間將其凍干，并碾成粉末；用考馬斯亮藍法進行蛋白濃度測定，制作蛋白標準曲線；595nm處比色；將抗原溶于生理鹽水中，配制濃度為1μg/μl；免疫BALB/c小鼠；4-6周，加強免疫；

小鼠腹水的誘導

取10周齡的健康BALB/c小鼠，腹腔注射滅菌液體石蠟，每只0.5ml，7-10天后，收集雜交瘤細胞，離心，去上清，加入不含血清的培養(yǎng)基，調(diào)節(jié)細胞密度為3×10⁷個/ml，每只小鼠注射1ml；設陰性對照、鹽水對照；10天后，小鼠腹部增大，開始收集腹水；用12號針頭扎入腹部，擠壓，使腹水流出，收集至離心管，并使勁晃動離心管防止腹水凝結(jié)；1000轉(zhuǎn)離心5分鐘，吸取上清，注意去掉上面一層脂肪；分裝，-20℃凍存；

j、膠體金的制備采用檸檬酸三鈉還原法并稍作改進制備膠體金；膠體金制備，取1％氯金酸溶液2.5ml加入到250ml容量瓶中，加雙蒸水至標定刻度線，使氯金酸溶液的濃度為1‰，沸水浴10min，加入1％檸檬酸三鈉溶液6.65ml；快速攪拌直至顏色徹底變?yōu)樽霞t色，繼續(xù)沸水10min，取出；涼至室溫后，用雙蒸水恢復至原體積；置4℃冰箱保存?zhèn)溆茫?/p>

測定膠體金在515nm波長具有最大吸收峰，確定膠體金直徑大小為10nm；

膠體金探針制備，取新鮮制備的膠體金溶液50ml，加入0.2mol/L?K₂CO3，調(diào)pH至8.2，置磁力攪拌器上調(diào)適量轉(zhuǎn)速，然后加入適量的已純化好的抗體；

使抗體濃度恰好在穩(wěn)定蛋白質(zhì)的最小量上；緩慢攪拌10min，加入牛血清白蛋白BSA，使BSA的終濃度為1％，繼續(xù)攪拌10min。將上述膠體金一抗體一BSA液進行4000r/min離心20min，收集上清；將收集的上清進行4℃、10000r/min離心60min；棄上清，沉淀用含1％BSA的0.01mol/L。pH7.4PBS懸?。煌?℃，10000r/min離心60min兩次，最后將沉淀用5ml?PBS-T溶解；4℃冰箱保存?zhèn)溆茫?/p>

層析試紙條組裝試紙條由吸水纖維、硝酸纖維膜、玻璃纖維和PVC板組成；硝酸纖維膜處理，中段相隔5mm分別用羊抗鼠IgG對照線和單核李斯特菌抗體檢測線劃線，形成兩條寬約1mm的線段，干燥后用含1％BSA的PBS封閉過夜，37℃干燥；

試紙條組裝，取潔凈PVC板，將處理好的硝酸纖維膜粘在PVC板中部合適位置；將2cm吸水纖維粘在PVC板上端并部分壓在硝酸纖維膜上，0.8cm玻璃纖維粘在PVC板下端并部分壓在硝酸纖維膜上，切成寬5mm的條帶，即為層析試紙條；干燥劑密封冷凍保存。