[發明專利]一種人血管內皮抑制肽的制備方法

無效

• 申請號: 201110448826.0
• 申請日: 2011-12-29
• 公開（公告）號: CN103183733A
• 公開（公告）日: 2013-07-03
• 發明（設計）人: 徐巖;李鄭武;王忠;高晶;李金花;宋紫玉;曹翊婕;李會成;王麗娜;黃宇紅;李曲亮;程廣偉
• 申請（專利權）人: 哈藥集團生物工程有限公司;哈藥集團技術中心
• 主分類號: C07K14/47
• 分類號: C07K14/47;C07K1/06;C07K1/04
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

技術領域

本發明涉及生物技術制藥領域的多肽類藥物，及其制備方法和抗腫瘤應用。

背景技術

腫瘤是一種多基因、多因素疾病，傳統的腫瘤治療包括手術、化療、放療等，主要直接以腫瘤細胞為靶點，存在術后殘留，藥物傳遞和穿透性問題，及對化療、放療不敏感、耐藥等缺點。而腫瘤的生長是血管依賴性的，當腫瘤直徑≤2?mm時，腫瘤細胞間通過彌散作用吸取營養，稱為“血管前期”；當腫瘤進一步增大時，則需新生毛細血管來提供營養，稱為“血管期”。血管新生對腫瘤的發生、發展和轉移密切相關，因此，20世紀70年代初Folkman提出腫瘤抗血管療法，這一設想為越來越多的證據所支持，并使這一領域成為腫瘤研究的熱點及腫瘤治療的新策略。在多種血管生成抑制劑當中，內皮抑素（endostatin）是目前作用最強、實驗效果最好的腫瘤血管生成抑制劑。

內皮抑素是一種血管生成抑制因子，為20?kd分子量蛋白質，由膠原蛋白ⅩⅧ的羧基末端的184個氨基酸殘基組成。能特異性的抑制內皮細胞的增殖和血管的生成，抑制腫瘤的形成和轉移。它的結構中有一個由11個精氨酸組成的堿性區域，這一區域對肝素有較強的親和力，可能是發揮對血管內皮細胞抑制作用的關鍵結構區域。內皮抑素的分子結構揭示是一個高度折疊的分子構象，而內皮抑素N末端的無規則卷曲結構提示：它的功能活性區可能最小化在N端的這幾十個氨基酸中。

發明內容

本發明的目的是提供一種具有抗腫瘤功能的多肽及其制備方法，本發明多肽的制備方法可以采用多肽合成方法制備，本發明優選的制備方法如下：

本發明的抗癌多肽優選采用反應條件溫和、副反應少及產率高的Fmoc保護氨基酸固相合成法。以Fmoc-Asp(OtBu)-Wang為起始原料，用20%的哌啶(PIP)/?N,N-二甲基甲酰胺(DMF)溶液脫去Fmoc保護基，縮合劑為N,N-二異丙基碳二亞胺(DIC)，從序列C端向N端方向依次接入保護氨基酸(Fmoc-AA)合成得32肽樹脂，用裂解液[TFA/水/三異丙基硅烷/1,2-二巰基乙醇=94:2:2:2（V/V）]裂解，無水乙醚沉淀出抗癌多肽的粗品，采用制備液相系統，反相C18填料精制純化、脫鹽后得精制液，經凍干后得成品，純度98%以上。

化學結構：?

H-His-Ser-His-Arg-Asp-Phe-Gln-Pro-Val-Leu-His-Leu-Val-Ala-Leu-Asn-Ser-Pro-

Leu-Ser-Gly-Gly-Met-Arg-Gly-Asp-Arg-Gly-Arg

分子式：C₁₃₅H₂₁₄N₄₆O₄₁S

分子量：3169.56

本發明的有益效果主要體現在固相合成抗腫瘤多肽，采用Fmoc-Asp(OtBu)-Wang樹脂為原料；用N,N-二甲基甲酰胺(DMF)作溶劑，α-氨基脫保護劑為20%哌啶(PIP)，縮合劑為N,N-二異丙基碳二亞胺(DIC)，產品過程消旋化低，產品質量好，純度高。后續處理簡單，有利于工業化生產。

附圖說明

圖1是本發明的工藝流程圖

?具體實施方式

以下說明并不構成對本專利的限制。

實施例1：?多肽的合成

（1）將Fmoc-Asp(OtBu)-Wang?用DMF溶脹30分鐘，除去DMF后加?20%的PIP/DMF溶液攪拌反應5分鐘，用DMF洗滌，洗滌2次。

（2）再加入20%的PIP/DMF溶液，攪拌反應25分鐘后，用DMF洗滌2次，進行茚三酮檢測應呈陽性。

（3）稱取Fmoc-?Gly?-OH（樹脂所含氨基摩爾數的3-5倍）和等摩爾的1-羥基-苯并-三氮唑（HOBt）用DMF溶解，冰浴冷卻30min；另取等摩爾的DIC，再用DCM稀釋一倍，于0℃～-10℃水浴預冷，將冷卻的DIC溶液加入至Fmoc-?Gly?–OH的DMF溶解中，繼續冷卻攪拌反應60min以上，加入到反應柱中進行縮合反應，反應結束后（用茚三酮顯色法檢測不顯色）用DMF洗滌3次完成一次接肽反應。

（4）重復去除Fmoc保護基及接肽反應步驟的操作，按照SEQ?ID?NO:4序列，更換不同的氨基酸逐步進行偶聯，直至最后Fmoc-His(Trt)-OH偶聯完畢。