[發明專利]一種人血管內皮抑制肽的制備方法

無效

• 申請號: 201110448826.0
• 申請日: 2011-12-29
• 公開（公告）號: CN103183733A
• 公開（公告）日: 2013-07-03
• 發明（設計）人: 徐巖;李鄭武;王忠;高晶;李金花;宋紫玉;曹翊婕;李會成;王麗娜;黃宇紅;李曲亮;程廣偉
• 申請（專利權）人: 哈藥集團生物工程有限公司;哈藥集團技術中心
• 主分類號: C07K14/47
• 分類號: C07K14/47;C07K1/06;C07K1/04
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

1.一種人血管內皮抑制肽：H-His-Ser-His-Arg-Asp-Phe-Gln-Pro-Val-Leu-His-Leu-Val-Ala-Leu-Asn-Ser-Pro-Leu-Ser-Gly-Gly-Met-Arg-Gly-Asp-Arg-Gly-Arg固相合成制備工藝，其特征在于所述方法包括如下順序步驟：⑴以Fmoc-Asp(OtBu)-Wang樹脂為原料依次連接以下保護基；⑵用去保護劑20%?PIP/DMF室溫處理；⑶加入裂解試劑；⑷過濾并洗滌；⑸純化；⑹濃縮。

2.根據權利要求1中步驟⑴，以Fmoc-Asp(OtBu)-Wang樹脂為原料，進行程序反應，依次連接以下保護基：Fmoc-Gly，Fmoc-Arg(Pbf)，Fmoc-Asp(OtBu)，Fmoc-Gly，Fmoc-Arg(Pbf)，Fmoc-Met，Fmoc-Gly，Fmoc-Gly，Fmoc-Ser(tBu)，Fmoc-Leu，Fmoc-Pro，Fmoc-Ser(tBu)，Fmoc-Asn(Trt)，Fmoc-Leu，Fmoc-Ala，Fmoc-Val，Fmoc-Leu，Fmoc-His(Trt)，Fmoc-Leu，Fmoc-Val，Fmoc-Pro，Fmoc-Gln(Trt)，Fmoc-Phe，Fmoc-Asp(OtBu)，Fmoc-Arg(Pbf)，Fmoc-His(Trt)，Fmoc-Ser(tBu)，Fmoc-His(Trt)，得到Fmoc-His(Trt)-Ser(tBu)-His(Trt)-Arg(Pbf)-Asp(OtBu)-Phe-Gln(Trt)-Pro-Val-Leu-His(Trt)-Leu-Val-Ala-Leu-Asn(Trt)-Ser(tBu)-Pro-Leu-Ser(tBu)-Gly-Gly-Met-Arg(Pbf)-Gly-Asp(OtBu)-Arg(Pbf)-Gly-Asp(OtBu)-Wang樹脂；

程序反應如下：

(a)保護氨基酸預處理：取1~5當量的保護氨基酸，1~5當量的HOBt，用N,N-二甲基甲酰胺(DMF)溶解，DMF的用量為樹脂的體積的40～60%，再將溶液置于0℃～-10℃的水浴環境中攪拌冷卻30Min以上；另取等摩爾的DIC，再用DCM稀釋一倍，于0℃～-10℃水浴預冷，后將DIC溶液慢慢加入至保護氨基酸DMF溶解中，繼續冷卻攪拌反應60min以上,備用；

(b)脫保護基：用DMF溶劑使樹脂溶脹并洗滌，用去保護劑20%?PIP/DMF將樹脂預洗1次，再用去保護劑與樹脂反應25分鐘，脫去Fmoc-保護基；

(c)洗滌：用DMF洗滌2次，每次2min，DCM洗滌2次，每次2min，再用DMF洗滌2次，每次2min；

(d)連接保護氨基酸：加入處理后的保護氨基酸溶液進行縮合反應，縮合反應基本控制在3小時或3小時以上；

(e)洗滌：用DMF洗滌2次，每次2min，DCM洗滌2次，每次2min。

3.根據權利要求1中步驟⑵，用去保護劑20%?PIP/DMF室溫處理，得到His(Trt)-Ser(tBu)-His(Trt)-Arg(Pbf)-Asp(OtBu)-Phe-Gln(Trt)-Pro-Val-Leu-His(Trt)-Leu-Val-Ala-Leu-Asn(Trt)-Ser(tBu)-Pro-Leu-Ser(tBu)-Gly-Gly-Met-Arg(Pbf)-Gly-Asp(OtBu)-Arg(Pbf)-Gly-Asp(OtBu)-Wang樹脂。

4.根據權利要求1中步驟⑶，加入裂解試劑[TFA/水/三異丙基硅烷/1,2-二巰基乙醇=94:2:2:2（V/V）]，一般為10～13ml/克肽樹脂，攪拌均勻，再加入干燥的肽樹脂，攪拌反應3-5小時，反應溫度20～30℃。

5.根據權利要求1中步驟⑷，過濾的濾液用少量TFA洗滌2次，合并濾液，30～35℃減壓濃縮至初始體積的30%得到濃縮液，加到-10℃無水乙醚（30ml/克肽樹脂），搖勻后在-10℃以下沉淀60分鐘，過濾收集沉淀，再用少量-10℃左右冷藏的無水乙醚洗滌兩次，轉移至干燥盤中，放置在風柜中揮干乙醚，得到肽的TFA鹽粗品。

6.根據權利要求1中步驟⑸，25～45%醋酸溶液溶解，濾膜過濾，采用高效液相色譜法進行純化，采用梯度洗脫收集主峰在30～40℃減壓濃縮，得到肽的TFA鹽。

7.根據權利要求1中步驟⑸，在小于40℃水浴條件下減壓濃縮，用旋轉蒸發儀蒸去大部分乙腈，得到CS8023醋酸鹽水溶液，凍干既得產品。