[發明專利]通用ACTB基因熒光定量聚合酶鏈式反應試劑盒

無效

• 申請號: 201110448551.0
• 申請日: 2011-12-29
• 公開（公告）號: CN102517395A
• 公開（公告）日: 2012-06-27
• 發明（設計）人: 劉欽松;夏慶杰
• 申請（專利權）人: 山東博奧克生物科技有限公司
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68;G01N21/64
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

技術領域

本發明涉及一種操作簡便、快速，且能夠定量檢測人、大鼠、小鼠三個物種β-肌動蛋白(Beta-actin，ACTB)基因mRNA表達的DNA體外擴增試劑盒，該發明屬于分子生物學檢測技術中的熒光定量DNA體外擴增技術領域。

背景技術

聚合酶鏈式反應(polymerase?chain?reaction，PCR)是現有的DNA體外擴增技術中最常用、也是最有效的技術；該技術系將耐熱DAN聚合酶、特異引物、dNTPs底物、模板DNA、鎂離子等放在同一個緩沖反應體系中，進行反復高溫變性、低溫退火、中溫鏈延伸的熱循環，從而達到靶DNA片段在反應液中呈2n倍擴增(其中n為熱循環次數)；熒光定量PCR技術則在PCR反應的基礎上，耦合以實時熒光檢測和計算機分析技術，即在PCR反應體系中加入特定的熒光物質，通過檢測每個熱循環后PCR反應體系中的熒光變化情況來實時探測DNA的擴增情況，并獲得每個標本的熒光定量變化曲線，進而獲得每個反應管的Ct值(熒光變化達到閾值時的循環數)；同時，在相同的反應體系和反應條件下檢測4-5個倍數稀釋的已知數量的靶標DNA，獲得其Ct值，以起始模板數的對數為橫坐標，以Ct值為縱坐標制備標準曲線，據此標準曲線和各個標本的Ct值對每個反應的起始DNA模板數進行定量測定；TaqMan探針技術是目前最常用的熒光定量PCR技術；TaqMan探針是一條能夠與待擴增檢測的靶DNA序列互補配對的寡核苷酸，其5’端標記了一個熒光報告基團(R)，其3’端標記了一個熒光淬滅基團(Q)；當該探針處于游離狀態或者沒有發生反應時，R所產生的熒光將被Q淬滅；在PCR退火過程中，該探針可與目標基因發生雜交，并由TaqDNA聚合酶的依賴于聚合的外切活性切斷，使得R與Q分離，游離的R發出熒光被熒光檢測裝置檢測；隨著PCR反應的進行，游離的R與PCR產物相對應地增加；因此，根據R產生的熒光信號的強弱，即可間接測量出PCR反應產物的數量；再依據標準曲線即可對每個反應的起始DNA模板數進行定量測定。

在熒光定量PCR檢測中，經常遇到檢測基因相對表達量的情況，其中內對照基因常常選擇ACTB；有鑒于此，我們通過大量的實驗研究優選出了一套能夠有效檢測人、大鼠、小鼠三個物種ACTB基因表達的引物和探針，優化出了其PCR反應的條件，并組裝成通用ACTB基因表達檢測熒光定量聚合酶鏈反應試劑盒，以滿足生命科學研究和醫學檢測的需要。

發明內容

本發明的技術方案是：首先獲得人、大鼠、小鼠的ACTB標準序列，進行BLAST同源性比較，再根據比較結果設計相應的引物和探針，最后將引物、探針加入含有耐熱DNA聚合酶、dNTPs、模板cDNA、鎂離子、PCR緩沖液、超純水等組成的PCR擴增緩沖反應體系中，在熱循環儀上進行高溫、低溫、中溫的反復熱循環；并在中溫時檢測和記錄熒光值。

所優選出的引物和探針的序列分別如下：

上游引物P1：5’-GAA?GAT?CAA?GAT?CAT?TGC?TCC?T-3’(SEQ?ID?NO：1)；

下游引物P2：5’-TGG?ATC?AGC?AAG?CAG?GAG?TA-3’(SEQ?ID?NO：2)；

TaqMan探針序列：5’-FAM-CTG?TCC?ACC?TTC?CAG?CGA-TAMRA-3’(SEQ?ID?NO：3)

所優化出的PCR擴增緩沖反應體系是由引物、探針、耐熱DNA聚合酶、dNTPs、模板DNA、Mg²⁺、PCR緩沖液、超純水等組成的，各個成分的終濃度分別如下：特異的引物和探針每條0.28umol/L、Taq?DNA聚合酶1.5/50ul、dNTPs底物0.25mmol/L、模板cDNA若干、Mg²⁺2.5mmol/L、緩沖液1×PCR；其中1×PCR緩沖液包括50mmol/L?KCl、10mmol/LTris·HCl?PH8.3、0.01％明膠。

該ACTB熒光定量PCR由于引物和探針在人、大鼠、小鼠中完全同源，所以能夠有效擴增來源于這些物種的ACTB基因，從而檢測ACTB基因的表達量。

根據上述研究結果，將上述引物、探針和其他PCR試劑混合后分裝到PCR擴增管中，并配以10E+8/ML、10E+7/ML、10E+6/ML、10E+5/ML、10E+4/ML等系列稀釋度的標準ACTB基因模板組裝成通用ACTB基因熒光定量聚合酶鏈反應試劑盒。標準ACTB基因模板的序列為：