[發明專利]用哺乳動物細胞系生產禽呼腸孤病毒與疫苗

有效

• 申請號: 201110448196.7
• 申請日: 2011-12-29
• 公開（公告）號: CN103184194A
• 公開（公告）日: 2013-07-03
• 發明（設計）人: 張許科;孫進忠;白朝勇
• 申請（專利權）人: 普萊柯生物工程股份有限公司
• 主分類號: C12N7/00
• 分類號: C12N7/00;C12N7/02;A61K39/15;A61P31/14
• 代理公司: 北京華夏正合知識產權代理事務所(普通合伙) 11017
• 代理人: 韓登營

技術領域

本發明涉及一種用哺乳動物細胞系生產的禽呼腸孤病毒與疫苗的方法及產品，屬于獸用疫苗領域。

背景技術

禽呼腸孤病毒(Avian?Reovirus，簡稱ARV)在世界范圍內廣泛存在，廣泛流行于雞、火雞中，它引起的關節炎、腱鞘炎及免疫抑制等給養雞業帶來重大經濟損失。目前，我國控制禽呼腸孤病毒的主要手段是使用減毒活疫苗或全病毒滅活苗通過免疫接種來控制雞呼腸孤病毒感染，而我國目前所用的禽呼腸孤病毒疫苗均為國外進口疫苗，使用雞胚或雞胚成纖維細胞培養生產病毒，使得制備的疫苗價格很高，且工藝復雜，造成養殖戶防治ARV的成本升高。

發明內容

有鑒于此，本發明的主要目的在于提供一種用哺乳動物細胞系生產的禽呼腸孤病毒及禽呼腸孤病毒滅活疫苗及其方法，以提供一種雞胚源的滅活疫苗批間差異更小，免疫效力更佳的禽呼腸孤病毒滅活疫苗，從而實現更安全、更有效地生產禽呼腸孤病毒及疫苗的目的。

技術方案

用哺乳動物細胞系生產禽呼腸孤病毒的方法，包括以下步驟：

1)將收獲的禽呼腸孤病毒，接種至長滿單層的哺乳動物細胞系，使用細胞維持液培養；

2)接種培養后，收獲禽呼腸孤病毒

優選地，用哺乳動物細胞系生產禽呼腸孤病毒的方法，上述步驟1)具體地包括：

a)細胞毒種的繁殖，即：使用禽腎細胞對禽呼腸孤病毒繼代；

b)禽呼腸孤病毒適應哺乳動物細胞的步驟，即：將經過繼代處理的禽呼腸孤病毒，接種于長滿單層的哺乳動物細胞系，使用細胞維持液培養，至出現CPE大于75％時，收獲禽呼腸孤病毒，作為制苗用毒種；

c)制苗毒液的繁殖，即：將收獲的禽呼腸孤病毒，接種至長滿單層的哺乳動物細胞系，使用細胞維持液培養；

優選地，上述步驟2)為制苗毒液的收獲，即：接種培養6～7天后，收獲禽呼腸孤病毒。

本發明對所用的哺乳動物細胞系沒有特別的限制，即本發明可以使用任意的哺乳動物細胞系；優選地，可以使用Vero細胞系(非洲綠猴腎細胞系)、MDCK細胞系(馬-達二氏犬腎細胞系)、PK-15細胞系(豬腎細胞系)、Marc145細胞(上皮樣細胞系，來源于猴腎細胞)、ST細胞(豬睪丸細胞系)、IBRS-2細胞(豬腎細胞系)任意一種或幾種細胞系；更優選地，使用Vero細胞系或MDCK細胞系；最優選地，使用Vero細胞系生產禽呼腸孤病毒與疫苗。

優選地，本發明的禽呼腸孤病毒在接種至哺乳動物細胞系生產前，要使用禽類腎細胞繼代(在本發明中也可以稱為傳代)14代～18代；更優選地，使用SPF雞胚腎細胞(CK細胞)進行繼代(或傳代)；最優選地，在繼代處理后還包括在使用前在禽腎細胞繼代(或傳代)一次。

優選地，本發明步驟2)收獲的禽呼腸孤病毒的效價為大于4×10⁷TCID₅₀/ml。

本發明對禽呼腸孤病毒沒有特別的限制，即本發明的方法可以使用哺乳動物細胞系生產任意類型的禽呼腸孤病毒；優選地，本發明所述的禽呼腸孤病毒是禽呼腸孤病毒AV2311株。

本發明的另一目的在于提供一種用哺乳動物細胞系生產禽呼腸孤病毒滅活疫苗的方法，即使用上述方法獲得的禽呼腸孤病毒，加入滅活劑，滅活后加入獸藥學上可接受的疫苗佐劑，乳化后獲得禽呼腸孤病毒滅活疫苗。

由上可知，本發明可以使用哺乳動物細胞系生產禽呼腸孤病毒及禽呼腸孤病毒滅活疫苗。即，發明人意外地發現在禽呼腸孤病毒在禽類腎細胞繼代處理后，可以幫助禽呼腸孤病毒更適應在哺乳動物細胞上的生長與繁殖，從而獲得一種高滴度、質量批次穩定的禽呼腸孤病毒；另外，發明人還發現在利用哺乳動物細胞培養禽呼腸孤病毒前，使用至少一次的禽源細胞預培養或適應，可以使得禽呼腸孤病毒在哺乳動物細胞的生產更有利。因此，本發明可以利用哺乳動物細胞來生產禽呼腸孤病毒，而利用本發明的禽呼腸孤病毒在哺乳動物細胞系獲得的禽呼腸孤病毒滅活疫苗比雞胚源的滅活疫苗批間差異更小，免疫效力更佳。

具體實施方式

本發明實施例中使用了常見的商業化的容易培養的細胞系如Vero細胞(非洲綠猴腎細胞)、BHK-21細胞(幼倉鼠腎傳代細胞)、PK-15細胞(豬腎細胞)、Marc145細胞(上皮樣細胞，來源于猴腎細胞)、ST細胞(豬睪丸細胞)、IBRS-2細胞(豬腎細胞)等細胞或細胞系生產禽呼腸孤病毒及疫苗。