[發(fā)明專(zhuān)利]同時(shí)檢測(cè)四種病毒的引物、引物對(duì)、方法及試劑盒

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201110448164.7
• 申請(qǐng)日: 2011-12-22
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN103088150A
• 公開(kāi)（公告）日: 2013-05-08
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 黃怡仁;陳郁璇
• 申請(qǐng)（專(zhuān)利權(quán)）人: 臺(tái)灣糖業(yè)股份有限公司
• 主分類(lèi)號(hào): C12Q1/70
• 分類(lèi)號(hào): C12Q1/70;C12Q1/68;C12N15/11;C40B40/06;C12R1/94
• 代理公司: 北京律盟知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理有限責(zé)任公司 11287
• 代理人: 章蕾

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及病毒的檢驗(yàn)技術(shù)。具體地講，本發(fā)明涉及利用蘭花病毒專(zhuān)一性引物及引物對(duì)同時(shí)檢測(cè)數(shù)種蘭花病毒的檢驗(yàn)技術(shù)。

背景技術(shù)

蘭花是重要花卉產(chǎn)品，極具經(jīng)濟(jì)價(jià)值，其中又以蝴蝶蘭為主要花卉。例如，臺(tái)灣的出口量歷年來(lái)呈現(xiàn)正向成長(zhǎng)現(xiàn)象，于2009年出口金額已達(dá)20億臺(tái)幣。蘭花跟所有植物一樣，于栽培過(guò)程中都可能面臨病蟲(chóng)害的威脅，而導(dǎo)致生長(zhǎng)與質(zhì)量上的損失。對(duì)于大多數(shù)感染蘭花的病害而言，只要運(yùn)用傳統(tǒng)的防治方法例如施用藥劑，均可獲得良好的防治效果，唯獨(dú)由濾過(guò)性病毒所感染的病毒病至今仍缺乏有效的治療對(duì)策。因此，病毒造成的病害可說(shuō)是目前最困擾蘭花產(chǎn)業(yè)的病害。

病毒之所以成為蘭花產(chǎn)業(yè)上最受關(guān)切的病原，其主要原因在于病毒可在蘭花植株上造成全株統(tǒng)性感染，使蘭株生長(zhǎng)緩慢，葉片出現(xiàn)條紋、斑塊、壞疽或綠色分布不均的嵌紋病征。有些敏感的品種在花朵上也會(huì)出現(xiàn)色澤不均、畸形或提早凋萎等病征，嚴(yán)重?fù)p及蘭花的商品價(jià)值。

根據(jù)文獻(xiàn)的紀(jì)錄，可以感染蘭花的病毒種類(lèi)至少有28種。但證實(shí)在臺(tái)灣地區(qū)發(fā)生的只有蕙蘭(東亞蘭)嵌紋病毒(Cymbidium?mosaic?virus，簡(jiǎn)稱(chēng)CyMV)、齒舌蘭輪斑病毒(Odontoglossum?ringspot?virus，簡(jiǎn)稱(chēng)ORSV)、胡瓜嵌紋病毒(Cucumber?mosaic?virus，簡(jiǎn)稱(chēng)CMV)及番椒黃化病毒(Capsicum?chlorosis?tospovirus，簡(jiǎn)稱(chēng)CaCV)等四種，其中又以CyMV及ORSV感染情況最普遍，對(duì)蘭花產(chǎn)業(yè)嚴(yán)重影響。在臺(tái)灣CaCV感染雖不普遍，但由于其感染蝴蝶蘭后造成的黃化輪斑與凹陷壞疽病征首在臺(tái)灣發(fā)現(xiàn)，因此CaCV被稱(chēng)為「臺(tái)灣病毒(Taiwan?virus)」，這對(duì)臺(tái)灣蝴蝶蘭市場(chǎng)造成相當(dāng)大的沖擊。然而，后續(xù)研究發(fā)現(xiàn)，世界各國(guó)的辣椒、蕃茄、花生及大巖桐早已有感染CaCV的歷史，其中茄科作物(如蕃茄、辣椒、甜椒及煙草等)對(duì)CaCV有高度感病性，感染后會(huì)造成輪斑、萎凋甚至死亡。因此，CaCV雖然在臺(tái)灣蝴蝶蘭感染尚不及CyMV及ORSV普及，但其對(duì)農(nóng)業(yè)上可造成的農(nóng)作損害卻非常廣泛且嚴(yán)重。

跟所有作物一樣，要栽培健康完美的蘭花，無(wú)病的健康種苗為重要因素。國(guó)際市場(chǎng)上對(duì)于蘭花除了于品種與美觀考量外更出現(xiàn)「無(wú)病毒健康苗」的競(jìng)爭(zhēng)。面對(duì)國(guó)際市場(chǎng)競(jìng)爭(zhēng)，產(chǎn)業(yè)界開(kāi)始應(yīng)用「組織培養(yǎng)技術(shù)」復(fù)制分生苗，降低種苗病毒感染率。以現(xiàn)今蝴蝶蘭產(chǎn)業(yè)為例，約有二成的種苗乃利用親本授粉所結(jié)的種子繁殖而來(lái)，稱(chēng)為「實(shí)生苗」，其余約八成的種苗乃藉由無(wú)性組織培養(yǎng)技術(shù)，將優(yōu)良性狀的植株大量復(fù)制成為具有完全相同性狀的種苗，這種種苗稱(chēng)為「分生苗」。不過(guò)分生苗雖然可以復(fù)制其親本植株的所有優(yōu)良性狀，但也可能繼承其親本所感染的「病毒病」，而影響后續(xù)的栽培、生育與開(kāi)花質(zhì)量。因此優(yōu)良性狀的蘭株必須經(jīng)過(guò)病毒檢測(cè)程序，確定無(wú)病毒感染后，才能進(jìn)行分生組織培養(yǎng)大量復(fù)制分生苗，此種程序已成為現(xiàn)今國(guó)際蘭花產(chǎn)業(yè)界的普識(shí)作為。

要確實(shí)執(zhí)行種苗的病毒驗(yàn)證，必須仰賴(lài)敏感及有效率的病毒檢測(cè)技術(shù)，才能準(zhǔn)確篩選感染病毒的植株。過(guò)去二十年來(lái)國(guó)際上最廣泛應(yīng)用于植物種苗病毒檢測(cè)的技術(shù)為酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(Enzyme-linked?immunosorbent?assay，簡(jiǎn)稱(chēng)ELISA)。然而近年來(lái)多項(xiàng)研究證據(jù)顯示蘭花受到病毒侵入后常會(huì)呈現(xiàn)潛隱性感染，于病組織中僅累積微量病毒，因而超出ELISA的檢測(cè)范圍，導(dǎo)致漏檢的情況發(fā)生。

已有報(bào)導(dǎo)提供「四種蘭花病毒免疫快速檢測(cè)試劑研發(fā)的抗原與抗體」，其提供針對(duì)ORSV、CyMV、CaCV及CMV等蝴蝶蘭病毒的血清檢測(cè)與高敏感度的核酸檢測(cè)試劑與技術(shù)(請(qǐng)參行政院農(nóng)業(yè)委員會(huì)農(nóng)業(yè)試驗(yàn)所技轉(zhuǎn)公告「四種蘭花病毒免疫快速檢測(cè)試劑研發(fā)的抗原與抗體」http://www.tari.gov.tw/taric/modules/news/article.php？storyid＝450)。惟，該研究?jī)H提供針對(duì)此4種病原進(jìn)行ELISA的的抗體以及對(duì)照抗原，而無(wú)揭示關(guān)于核酸檢測(cè)的試劑及技術(shù)。

臺(tái)灣第096120312號(hào)發(fā)明專(zhuān)利申請(qǐng)案(公開(kāi)號(hào)200848735)揭示一種檢測(cè)蘭花病毒的試劑及方法，其利用分布于溶液中的磁性奈米顆粒，每一磁性奈米顆粒包括磁性層、接口活性劑層及多個(gè)蘭花病毒抗體。該專(zhuān)利申請(qǐng)案揭示以所述方法檢測(cè)CyMV、ORSV及CMV。