[發(fā)明專利]同時(shí)檢測(cè)四種病毒的引物、引物對(duì)、方法及試劑盒

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201110448164.7
• 申請(qǐng)日: 2011-12-22
• 公開（公告）號(hào): CN103088150A
• 公開（公告）日: 2013-05-08
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 黃怡仁;陳郁璇
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 臺(tái)灣糖業(yè)股份有限公司
• 主分類號(hào): C12Q1/70
• 分類號(hào): C12Q1/70;C12Q1/68;C12N15/11;C40B40/06;C12R1/94
• 代理公司: 北京律盟知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理有限責(zé)任公司 11287
• 代理人: 章蕾

1.一種同時(shí)檢測(cè)植物樣本中4種病毒感染的方法，其中這些病毒為蕙蘭嵌紋病毒(Cymbidium?mosaic?virus；CyMV)、齒舌蘭輪斑病毒(Odon?tglossum?ringspot?virus；ORSV)、胡瓜嵌紋病毒(Cucumber?mosaic?virus；CMV)及番椒黃化病毒(Capsicum?chlorosis?tospovirus；CaCV)，該方法包含下列步驟：

(a)提供植物樣本；

(b)提供對(duì)于CyMV、ORSV、CMV及CaCV的核酸具有專一性的引物及/或引物對(duì)；

(c)利用這些引物及/或引物對(duì)在可同時(shí)擴(kuò)增這些病毒核酸的條件下對(duì)該植物樣本進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈鎖反應(yīng)(RT-PCR)，以擴(kuò)增CyMV、ORSV、CMV及CaCV的特異性核酸；及

(d)檢測(cè)經(jīng)擴(kuò)增的樣本中是否含有這些病毒的核酸。

2.如權(quán)利要求1的方法，其中該CyMV的核酸來自CyMV的RNA依賴型RNA聚合酶基因、該ORSV的核酸來自O(shè)RSV的RNA依賴型RNA聚合酶基因、該CMV的核酸來自CMV的鞘蛋白基因，及該CaCV的核酸來自CaCV的核鞘蛋白基因。

3.如權(quán)利要求2的方法，其中：

該對(duì)于CyMV具有專一性的引物包括一寡核苷酸，其由下列序列組成：SEQ?ID?NO：7、SEQ?ID?NO：8的序列或與SEQ?ID?NO：7或SEQID?NO：8具90％以上同源性且與CyMV具有專一性的序列；及該對(duì)于CyMV具有專一性的引物對(duì)包括由SEQ?ID?NO：7的序列組成的寡核苷酸及由SEQ?ID?NO：8的序列組成的寡核苷酸；

該對(duì)于ORSV具有專一性的引物包括一寡核苷酸，其由下列序列組成：SEQID?NO：5、SEQ?ID?NO：6的序列或與SEQ?ID?NO：5或SEQ?ID?NO：6具90％以上同源性且與ORSV具有專一性的序列；及該對(duì)于ORSV具有專一性的引物對(duì)包括由SEQ?ID?NO：5的序列組成的寡核苷酸及由SEQ?ID?NO：6的序列組成的寡核苷酸；

該對(duì)于CMV具有專一性的引物包括一寡核苷酸，其由下列序列組成：SEQ?ID?NO：1、SEQ?ID?NO：2的序列或與SEQ?ID?NO：1或SEQ?ID?NO：2具90％以上同源性且與CMV具有專一性的序列；及該對(duì)于CMV具有專一性的引物對(duì)包括由SEQ?ID?NO：1的序列組成的寡核苷酸及由SEQ?ID?NO：2的序列組成的寡核苷酸；

該對(duì)于CaCV具有專一性的引物包括一寡核苷酸，其由下列序列組成：SEQ?ID?NO：3、SEQ?ID?NO：4的序列或與SEQ?ID?NO：3或SEQ?ID?NO：4具90％以上同源性且與CaCV具有專一性的序列；及該對(duì)于CaCV具有專一性的引物對(duì)包括由SEQ?ID?NO：3的序列組成的寡核苷酸及由SEQ?ID?NO：4的序列組成的寡核苷酸。

4.如權(quán)利要求1的方法，其進(jìn)一步包括使用內(nèi)標(biāo)引物及/或引物對(duì)，該內(nèi)標(biāo)引物及/或引物對(duì)可擴(kuò)增蝴蝶蘭肌動(dòng)蛋白基因的片段，該引物及/或引物對(duì)選自由SEQ?IDNO：9、SEQ?ID?NO：10、SEQ?ID?NO：11、SEQ?ID?NO：12及在可擴(kuò)增蝴蝶蘭肌動(dòng)蛋白基因片段的條件下與SEQ?ID?NO：9、SEQ?ID?NO：10、SEQ?ID?NO：11或SEQ?ID?NO：12的互補(bǔ)序列雜交的核酸序列所組成的群。

5.如權(quán)利要求1的方法，其中該反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈鎖反應(yīng)為實(shí)時(shí)反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈鎖反應(yīng)(real-time?RT-PCR)或多重反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈鎖反應(yīng)(multiplex?RT-PCR)。

6.如權(quán)利要求5的方法，其中該反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈鎖反應(yīng)為實(shí)時(shí)反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈鎖反應(yīng)，且該擴(kuò)增條件為：

-在50℃下反應(yīng)10分鐘；

-在95℃下反應(yīng)5分鐘；及

-在95℃下反應(yīng)15秒、在57℃下反應(yīng)15秒、在72℃下反應(yīng)15秒及在82℃下反應(yīng)15秒為1個(gè)循環(huán)，共重復(fù)30個(gè)循環(huán)。

7.如權(quán)利要求5的方法，其中該反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈鎖反應(yīng)為多重反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈鎖反應(yīng)，且該擴(kuò)增條件為：

-在42℃下反應(yīng)20分鐘；

-在94℃下反應(yīng)2分鐘；

-在95℃下反應(yīng)15秒、在57℃下反應(yīng)30秒及在72℃下反應(yīng)20秒為1個(gè)循環(huán)，共重復(fù)30個(gè)循環(huán)；及

-在72℃下反應(yīng)10分鐘。