[發明專利]一種甲醇型畢赤酵母的高密度發酵工藝及設備

無效

• 申請號: 201110446543.2
• 申請日: 2011-12-28
• 公開（公告）號: CN102517223A
• 公開（公告）日: 2012-06-27
• 發明（設計）人: 章方龍;楊海龍;章航
• 申請（專利權）人: 溫州市龍泰輕工機械有限公司
• 主分類號: C12N1/16
• 分類號: C12N1/16;C12M1/04;C12M1/02;C12R1/84
• 代理公司: 溫州高翔專利事務所 33205
• 代理人: 陳乾康

技術領域

本發明屬于生物發酵技術領域，涉及一種甲醇型畢赤酵母的高密度發酵工藝及設備。

背景技術

隨著生物學技術的發展，利用基因工程菌生產生物產品已成為現實。在微生物表達系統中，酵母作為單細胞低等真核生物，具有易培養、繁殖快、便于基因操作、能對外源蛋白進行翻譯后加工和修飾、不產生有毒物質等優點，成為分子生物學領域中被廣泛用于重組蛋白生產的系統之一。甲醇型巴斯德畢赤酵母（Pichia?pastoris）表達系統是目前最優秀、應用最廣泛的外源基因表達系統之一，它不但克服了大腸桿菌表達系統不能表達結構復雜的蛋白質、表達的蛋白多形成不溶性包涵體、背景蛋白多、表達產量低等缺陷，而且彌補了哺乳類細胞、昆蟲細胞表達系統操作復雜、表達水平低、產業化生產造價昂貴的不足。巴斯德畢赤酵母另一個特點是可以在廉價的非選擇性培養基中生長，可進行細胞高密度培養，利于大規模工業化生產。目前許多產品，如植酸酶、木聚糖酶、甘露聚糖酶等都在巴斯德畢赤酵母中獲得高效表達。

P.?pastoris是一種嗜甲基酵母，可以在以甲酵為唯一碳源和能源的培養基中快速生長。甲醇畢赤酵母代謝的第一步是氧化甲醇形成甲醛，這一步是由醇氧化酶(alcohol?oxidase,?Aox)催化的，在畢赤酵母利用甲醇的代謝途徑中存在兩個醇氧化酶，AOX1和AOX2。在甲醇流加培養時，AOX水平急劇上升，可達細胞可溶性蛋白的30%以上?，F在采用的策略是將外源基因替換AOXl基因，這種替換所產生的轉化子是最穩定的。AOXl的合成是在轉錄水平上調控的，其基因啟動子具有明顯的調空功能，可用于調控外源基因的表達。此調控作用是由碳源抑制/解抑制及碳源特殊誘導雙重機制控制的，即外源基因在甲醇以外的碳源中處于非表達狀態，而在培養液中加入甲醇后，外源基因即可被誘導表達。

在25℃和1.0×10⁵Pa氧在水中的溶解度僅為0.25?mmol.L-1左右。在發酵液中含有大量的有機物和無機鹽，氧的溶解度約為0.21?mmol.L-1，比糖的溶解度小7000倍。在對數生長期即使發酵液中的溶氧能達到100％飽和度，若此時中止供氧，發酵液中溶氧可在幾分鐘之內便耗竭，使溶氧成為限制因素。

溶氧(DO)是畢赤酵母生長所必需，尤其是在重組畢赤酵母高密度發酵工藝，在補料發酵階段，由于菌體的大量生長，耗氧速率增加，需氧量非常大；在接下來的甲醇誘導表達階段，甲醇通過畢赤酵母的醇氧化酶（AOX1和AOX2）進行代謝需要大量的氧參與，使溶氧成為甲醇型重組畢赤酵母高密度發酵的限制因素。目前的發酵工藝與設備無法在甲醇型重組畢赤酵母高密度發酵過程中達到供氧與耗氧的平衡。

因此，針對大規模工業化的甲醇型重組畢赤酵母高密度發酵，需要從反應器結果設計、供氣質量、菌種與發酵工藝的優化等方面提高氧的供給與利用率，防止發酵過程因缺氧而導致的發酵產率的降低。

發明內容

本發明所要解決的技術問題是：提供一種甲醇型畢赤酵母的高密度發酵工藝及設備，以克服目前甲醇型重組畢赤酵母高密度發酵過程中，在發酵工藝與設備方面的供氧不足等問題，防止發酵過程因缺氧而導致的發酵產率的降低。

本發明所采用的技術方案是：一種甲醇型畢赤酵母的高密度發酵工藝，包括分批發酵階段、補料發酵階段和甲醇誘導階段，在補料發酵階段和甲醇誘導階段，由氧氣發生器制得的高濃度氧氣流入氧氣儲罐，然后與進入發酵罐的空氣混合，使之氧氣含量在40%－60%，以1.00vvm的流量通入發酵罐，以維持發酵罐內發酵液氧的濃度高于同溫同壓下空氣中的氧氣在初始培養液中溶解度的30%。

本發明進一步技術方案是：提供一種應用于上述甲醇型畢赤酵母的高密度發酵工藝中的酵母高密度培養設備，該設備包括由管道依次連接的氧氣發生器、氧氣儲罐、氣水分離器、膜過濾器以及發酵罐。所述的發酵罐包括罐體、攪拌裝置和通氣裝置；所述攪拌裝置包括攪拌電機、固定在一根攪拌軸上的若干組攪拌漿，下層攪拌槳置于罐體底部且位于通氣裝置上方，中層攪拌槳置于罐體的中部，上層攪拌槳置于罐體的上部；所述通氣裝置為環形空氣分布器，環形空氣分布器上安置多個45度角的出氣小管，出氣小管上設有多個出氣孔引導氣體旋轉的方向與攪拌軸旋轉方向相反。