[發(fā)明專利]用于外源蛋白可溶性表達(dá)的質(zhì)粒及其制備和應(yīng)用方法

無效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201110446386.5
• 申請日: 2010-08-31
• 公開（公告）號: CN102533835A
• 公開（公告）日: 2012-07-04
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 張大兵;梁婉琪;袁政;申慧峰
• 申請（專利權(quán)）人: 上海交通大學(xué)
• 主分類號: C12N15/70
• 分類號: C12N15/70;C12N15/67;C12N15/64;C12R1/19
• 代理公司: 上海旭誠知識產(chǎn)權(quán)代理有限公司 31220
• 代理人: 鄭立

本發(fā)明專利申請為中國發(fā)明專利申請?zhí)?01010266983.5，申請日2010年8月31日，申請人“上海交通大學(xué)”，發(fā)明名稱“用于外源蛋白可溶性表達(dá)的質(zhì)粒及其制備和應(yīng)用方法”的分案申請。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及的是一種生物工程技術(shù)領(lǐng)域的質(zhì)粒及其制備和應(yīng)用方法，具體是一種利用產(chǎn)腸毒素大腸桿菌FaeE基因提高外源蛋白在大腸桿菌中可溶性表達(dá)的質(zhì)粒及其制備和應(yīng)用方法。

背景技術(shù)

大腸桿菌具有遺傳性狀了解透徹、生長快、培養(yǎng)經(jīng)濟(jì)、表達(dá)水平高、待選質(zhì)粒和宿主多等特點，在基因工程技術(shù)領(lǐng)域成為首選的表達(dá)系統(tǒng)。但是外源蛋白往往在獲得高水平表達(dá)的同時，容易被宿主蛋白酶降解或者形成包涵體。目前國內(nèi)外對蛋白質(zhì)體外復(fù)性研究較多，但其過程往往費時、費力，且不經(jīng)濟(jì)，因此，探索外源蛋白在大腸桿菌中的可溶性表達(dá)具有較高的學(xué)術(shù)價值和廣泛的應(yīng)用前景。

提高外源基因大腸桿菌中可溶性表達(dá)可以通過共表達(dá)的輔助蛋白，例如分子伴侶GroEL/ES和DnaK-Dnaj-GrpE、引發(fā)因子(Trigger?factor)、硫氧還蛋白(Thioredoxin)和折疊酶(Foldase)等以增加外源蛋白可溶性。但是應(yīng)根據(jù)外源蛋白的特點有選擇性地共表達(dá)分子伴侶和折疊酶。例如在大腸桿菌中共表達(dá)熱激蛋白GroEL/ES能增加某些蛋白(α-1，6-巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶、浸麻芽孢桿菌環(huán)式糊精葡聚糖轉(zhuǎn)移酶、谷氨酸消旋酶、過氧化物歧化酶、酪氨酸激酶、人膠原酶原)的可溶性，卻對其他一些蛋白(人I型干擾素受體2c亞基的胞外段、噬菌體P22結(jié)構(gòu)蛋白、人酸性富含胱氨酸分泌型蛋白)無增溶效果。又如GroEL/ES與人酪氨酸激酶Lck共表達(dá)并不能增加后者的可溶性，而硫氧還蛋白卻能顯著地促進(jìn)該外源蛋白在大腸桿菌中的可溶性表達(dá)。除此之外，溫度也可能會對共表達(dá)折疊輔助蛋白的效果產(chǎn)生重要的影響。例如preS2-S’-β-半乳糖苷酶與DnaK和DnaJ分子伴侶共表達(dá)，能在30至42℃范圍內(nèi)提高可溶蛋白的表達(dá)水平，而共表達(dá)GroEL和GroES分子伴侶卻只能在30℃條件下取得比較好的效果。值得一提的是，如果將幾種折疊輔助蛋白分子同時共表達(dá)，有可能獲得比單獨表達(dá)某種折疊輔助蛋白更好的效果。Jiro等將GroEI/ES，Trx或DsbBD與谷氨酸消旋酶同時共表達(dá)，活性谷氨酸消旋酶的產(chǎn)量上升了2.2至2.3倍。在某些情況下，共表達(dá)那些能增加蛋白可溶性和促進(jìn)大腸桿菌生長的蛋白也能起到良好的效果。例如Kallio等在大腸桿菌中共表達(dá)透明顫菌血紅蛋白，發(fā)現(xiàn)該蛋白對活性蛋白的表達(dá)有明顯促進(jìn)作用。

FaeE是產(chǎn)腸毒素大腸桿菌鞭毛蛋白上的一個分子伴侶，在體內(nèi)以同源二聚體的形式與鞭毛蛋白的其他亞基形成異源三聚體，從而保護(hù)這些亞基免受蛋白酶的降解，同時抑制這些亞基提前聚合，并將它們護(hù)送到跨膜蛋白。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明針對現(xiàn)有技術(shù)存在的上述不足，提供一種用于外源蛋白可溶性表達(dá)的質(zhì)粒及其制備和應(yīng)用方法，該方法構(gòu)建了一個包含有該分子伴侶FaeE的大腸桿菌表達(dá)載體，可以促進(jìn)外源蛋白在大腸桿菌中的可溶性表達(dá)。

本發(fā)明是通過以下技術(shù)方案實現(xiàn)的：

本發(fā)明涉及一種用于外源蛋白可溶性表達(dá)的質(zhì)粒，該質(zhì)粒為pET30e其DNA序列如Seq?ID?No.1所示，

所述的質(zhì)粒包含有分子伴侶FaeE的編碼序列，含有BamH?I，EcoR?I，Sac?I，Sal?I，Not?I，Xho?I限制性內(nèi)切酶識別位點組成的多克隆位點，其分子伴侶FaeE的編碼序列包括有起始密碼子ATG和終止密碼子TAA，分子伴侶FaeE的編碼序列和外源基因序列之間有一個大腸桿菌核糖體結(jié)合位點，分子伴侶FaeE的編碼序列和外源基因序列共同受T7啟動子和1ac操縱子的調(diào)控，外源基因序列末端與6個His-tag基因融合；

本發(fā)明涉及上述用于外源蛋白可溶性表達(dá)的質(zhì)粒的制備方法，通過將質(zhì)粒模板與引物組進(jìn)行PCR擴(kuò)增后獲得的擴(kuò)增產(chǎn)物與pMD18-T載體連接，經(jīng)轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α后獲得大腸桿菌克隆體，將大腸桿菌克隆體作為底物進(jìn)行酶切連接后將得到的產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α，獲得可溶性表達(dá)質(zhì)粒分子。

所述的大腸桿菌DH5α購自上海英駿生物技術(shù)有限公司；

所述的pMD18-T載體購自大連寶生物工程有限公司；

所述的將質(zhì)粒模板與引物組進(jìn)行PCR擴(kuò)增是指：

a)將F4ac型ETEC野生型菌株C83907質(zhì)粒與第一引物和第二引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增；或