[發(fā)明專利]檢測乙醇脫氫酶1B基因多態(tài)性的試劑盒及其擴增方法和檢測方法

無效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201110446187.4
• 申請日: 2011-12-28
• 公開（公告）號: CN103184267A
• 公開（公告）日: 2013-07-03
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 韓俊領(lǐng);杜宏偉;周毓玲;崔麗娟
• 申請（專利權(quán)）人: 協(xié)和干細胞基因工程有限公司;天津濱海協(xié)和基因科技有限公司
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68
• 代理公司: 天津才智專利商標代理有限公司 12108
• 代理人: 王曉紅

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及一種利用單管雙向等位基因特異性擴增技術(shù)結(jié)合分子開關(guān)技術(shù)檢測乙醇脫氫酶1B基因多態(tài)性的試劑盒和檢測方法，特別涉及一種檢測ADH1B基因rs1229984位點的單核苷酸多態(tài)性(SNP)的試劑盒以及PCR擴增方法，屬于生物醫(yī)學領(lǐng)域。

背景技術(shù)

乙醇脫氫酶(alcohol?dehydrogenase，ADH)介導的氧化途徑是酒精代謝的主要途徑，其多態(tài)性可以影響個體對酒精的代謝能力。ADH1B在第3外顯子處發(fā)生G143A點突變形成ADH1B*2，使得其編碼的亞單位β1的第47位的精氨酸被組氨酸替代，形成β2。ADH1B*2/*2等位基因編碼的酶活性是ADH1B*1/*1等位基因編碼的酶活性的40倍，加速了乙醇向乙醛的轉(zhuǎn)化，在短時間內(nèi)乙醛即大量累積。ADH1B基因多態(tài)性在不同種族存在差異，在亞洲人和白種人中，ADH1B*2等位基因頻率分別為60％～80％和0％～10％。

乙醇脫氫酶1B的多態(tài)性對個體的飲酒行為和多種疾病易感性有著重要的影響。具有*2/*2基因型個體由于飲酒后血中乙醛含量迅速升高，其擬交感神經(jīng)毒副作用刺激神經(jīng)組織釋放出兒茶酚胺作用于心血管系統(tǒng)和神經(jīng)系統(tǒng)，誘發(fā)臉紅、惡心、頭痛等反應，這類反應引發(fā)的主觀不適感降低了個體對飲酒的興趣，促其主動放棄繼續(xù)飲酒而阻抑過度飲酒的發(fā)生，因而此基因型被認為是飲酒的天然“抑制因子”。Muramatsu等對上海人和Thomasson等對中國臺灣人的研究發(fā)現(xiàn)非飲酒者ADH1B*2等位基因頻率高于飲酒者。

飲酒不僅能引起許多社會問題，而且對機體也產(chǎn)生一定的損害，長期酗酒可誘發(fā)一系列心腦血管疾病，機體某些組織器官的損傷，對身體產(chǎn)生嚴重的損害甚至引起腫瘤的發(fā)生。飲酒的健康危害主要由酒精及其中間代謝物乙醛引起，國外動物學研究證實，酒精的中間代謝產(chǎn)物乙醛是一種肯定性的致癌劑。ADH1B*2等位基因攜帶飲酒者有顯著的肝臟酶(如堿性磷酸酶，r一谷氨酰轉(zhuǎn)移酶，丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶)水平的升高，而這些酶與酒精性肝臟疾病的發(fā)生有關(guān)；酒精中毒是導致心臟非缺氧性損傷的主要因素，乙醛的加速生成可造成心肌細胞損傷引起一系列心腦血管疾病；持續(xù)性飲酒者唾液中乙醛水平升高，還可導致上消化道腫瘤的發(fā)生。

發(fā)明內(nèi)容

人乙醇脫氫酶1B基因遺傳多態(tài)性直接或間接影響患者飲酒行為和多種疾病的發(fā)生。本發(fā)明提供一種利用單管雙向等位基因特異性擴增技術(shù)結(jié)合分子開關(guān)技術(shù)檢測乙醇脫氫酶1B基因多態(tài)性的試劑盒及其擴增方法和檢測方法。

本發(fā)明采用的技術(shù)方案：一種檢測乙醇脫氫酶1B基因多態(tài)性的試劑盒，所述試劑盒在一個PCR反應中對ADH1B基因上rs1229984SNP位點進行分型。

所述試劑盒包括檢測ADH1B基因rs1229984SNP位點的外側(cè)雙向引物和2條雙向序列特異性引物。

所述檢測ADH1B基因rs1229984SNP的引物堿基序列如下所示：

外側(cè)正向引物：AGGGTACAATACATGAGTGCCTGAATGCA

外側(cè)反向引物：GTAGGGATTAGTAGCAAAACCCTCAAA

突變型引物：AACCACGTGGTCATCTGTGC

野生型引物：TAGGTGGCTGTAGGAATCTGTCA。

所述的檢測乙醇脫氫酶1B基因多態(tài)性的試劑盒所采用的檢測方法，對受檢樣本DNA用擴增緩沖液進行擴增，擴增后經(jīng)凝膠電泳在紫外光下見到根據(jù)片段大小區(qū)分開的產(chǎn)物條帶，擴增片段由大到小依次是：內(nèi)對照459bp，野生型產(chǎn)物337bp和突變產(chǎn)物164bp，根據(jù)條帶的有無判斷SNP位點的基因型。

所述的檢測乙醇脫氫酶1B基因多態(tài)性的試劑盒的擴增方法，包括以下步驟：

預變性由1次循環(huán)構(gòu)成，其條件為：

溫度為94℃，時間為5分鐘；

PCR擴增由30次循環(huán)構(gòu)成，其條件為：

變性：溫度為94℃，時間為30秒；

退火：溫度為56℃，時間為30秒；

延伸：溫度為72℃，時間為90秒；

擴增結(jié)束后于4℃保存至電泳檢測。

本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比具有下列優(yōu)點和效果：

(1)本發(fā)明采用單管雙向等位基因特異性擴增技術(shù)，在一次PCR反應中即可判斷SNP位點的基因型，提高檢測效率降低檢測成本。

(2)本發(fā)明采用SNP敏感性分子開關(guān)技術(shù)，使3’端不能與模板互補的引物所引發(fā)的擴增非成熟性終止，無法形成產(chǎn)物，避免假陽性結(jié)果的產(chǎn)生。