[發明專利]特異性引物組、包含其的試劑盒、使用方法及檢測方法

無效

• 申請號: 201110445529.0
• 申請日: 2011-12-28
• 公開（公告）號: CN102559928A
• 公開（公告）日: 2012-07-11
• 發明（設計）人: 趙玉然;李八方;岳志芹;馬亞;梁成珠;徐彪
• 申請（專利權）人: 中國海洋大學
• 主分類號: C12Q1/70
• 分類號: C12Q1/70;C12Q1/68;C12N15/11
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技術領域

本發明屬于病毒學、分子生物學領域，尤其涉及一種真鯛虹彩病毒檢測試劑盒。

背景技術

真鯛虹彩病毒(Red?sea?bream?iridovirus，RSIV)屬于虹彩病毒科(Iridoviridae)，細胞腫大病毒屬(Megalocytivirus)，主要感染真鯛、花鱸、條石鯛等海水魚類，該病最早爆發于日本，隨后，在東亞、東南亞相繼爆發。該病在自然界暴發時大多數很突然，致死率高，是目前對各國海水養殖危害最為嚴重的疾病之一，同時該病還嚴重影響經濟魚類的進出口貿易。該病被列為必須向世界動物衛生組織(OIE)上報的疫病，我國農業部將其列為二類疫病，并每年兩次對我國沿海海域進行該病的監控。

已有的真鯛虹彩病毒的檢測方法一般分為四種：細胞分離培養、電鏡觀察、免疫學方法和分子生物學方法。

細胞分離培養與分子生物學方法被認為是水生動物病毒性疫病檢測與鑒定的黃金法，但目前，用于分離真鯛虹彩病毒的細胞系很少，且敏感性差。

電鏡觀察方法是通過對感染病毒的細胞或組織(肝、脾、腎、腦)進行電鏡觀察，可以直接觀察包涵體和病毒的形態特征，對病毒進行初步的分類和診斷，但該方法同樣需要進一步的免疫學或分子生物學的方法進行確診，且操作繁瑣，不適合快速診斷。

免疫學方法可以確診虹彩病毒的不同屬，但屬間經常有交叉反應，由于水生動物作為一種低等脊椎動物，免疫反應遠遜色與哺乳動物，只能進行抗原的檢測，該方法不適合低劑量病毒感染的檢測與病毒監控的應用，對于不同的宿主，其靈敏度和特異性不盡相同。

PCR方法是世界動物衛生組織(OIE)謹慎推薦的一種水生動物疫病診斷的分子生物學方法，可以從感染虹彩病毒的水生動物的細胞系和有關組織(肝、脾、腦、腎)的核酸中擴增出目的片斷，但該方法需要對擴增片段進行測序以對擴增結果進行進一步的確定，同時，要設立陽性和陰性對照，防止假陽性和假陰性的出現，檢測周期長。就目前來講，PCR方法是虹彩病毒檢測較為適用的方法，但該方法仍存在一定的缺陷，PCR擴增產物須進行測序，耗時長，該方法需要進一步的改善。

真鯛虹彩病毒的檢測靶序列有很多，包括DNA聚合酶(DPOL)基因、ATP酶基因、Pst?I限制性位點、核酸還原酶小亞基(RNRS)基因、主要衣殼蛋白(MCP)基因等。MCP基因在決定病毒衣殼蛋白結構過程中具有重要作用，對決定病毒的血清型、基因型具有重要作用，該基因通常特異、保守，常被做為病毒分型與檢測的依據，適合做為虹彩病毒檢測與系統分類的依據，針對該序列設計的引物具有很好的特異性，以此為基礎建立的檢測方法具有很好的特異性。

環介導等溫擴增技術(Loop-Mediated?Isothermal?Amplification，簡稱LAMP)，是一種敏感性高、特異性強的靶DNA快速檢測方法，該方法針對靶DNA的6個區域設計特異性引物，檢測過程中不需要昂貴的儀器，檢測條件恒溫，快速、簡便，檢測結果可通過肉眼直接判斷，檢測靈敏度較常規PCR高。環介導等溫擴增技術目前已被廣泛應用于檢測水生動物的病原體，如魚類病毒(鯉春血癥病毒、傳染性胰臟壞死病毒、傳染性造血器官壞死病毒、錦鯉皰疹病毒)、對蝦病毒(對蝦白斑綜合癥病毒、黃頭病毒)、細菌(遲鈍愛德華氏菌)等。據檢索，目前尚未見采用環介導等溫擴增技術對真鯛虹彩病毒進行快速檢測的報道。

發明內容

本發明所要解決的技術問題是在于需要提供一種新型的真鯛虹彩病毒檢測試劑盒及其應用，利用環介導等溫擴增技術，以真鯛虹彩病毒主要衣殼蛋白(MCP)基因全基因序列為基礎設計6條引物，使目的片段通過在等溫環境中的循環置換擴增實現對靶序列的放大，從而達到檢測的目的，這種檢測真鯛虹彩病毒的試劑盒快速、高效、簡便，能滿足現場、即時檢測的要求，為我國水產養殖業和國際魚類貿易中的真鯛虹彩病毒的快速檢測提供技術支持。

為了解決上述技術問題，本發明提供了一種真鯛虹彩病毒檢測用的特異性引物組，所述特異性引物組是由如下6條特異性引物構成的：正向外引物(F3)、反向外引物(B3)、正向內引物(FIP)、反向內引物(BIP)、正向環引物(LF)及反向環引物(LB)。

其中，所述6條特異性引物構成的特異性引物組序列分別為，

RSIV-F3：5’-GTCACACCCGCAGACAAT-3’；

RSIV-B3：5’-ACCTCGGACAGGGGATTG-3’；

RSIV-FIP：

5’-TGCGGTGGGTGACGTTCTTTAC-TTTT-CTTGGTGCATCTGGACCTC-3’；