[發明專利]特異性引物組、包含其的試劑盒、使用方法及檢測方法

無效

• 申請號: 201110445529.0
• 申請日: 2011-12-28
• 公開（公告）號: CN102559928A
• 公開（公告）日: 2012-07-11
• 發明（設計）人: 趙玉然;李八方;岳志芹;馬亞;梁成珠;徐彪
• 申請（專利權）人: 中國海洋大學
• 主分類號: C12Q1/70
• 分類號: C12Q1/70;C12Q1/68;C12N15/11
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1.一種真鯛虹彩病毒檢測用的特異性引物組，其特征在于：所述特異性引物組是由如下6條特異性引物構成的：正向外引物(F3)、反向外引物(B3)、正向內引物(FIP)、反向內引物(BIP)、正向環引物(LF)及反向環引物(LB)。

2.如權利要求1所述的特異性引物組，其特征在于：

所述6條特異性引物構成的特異性引物組序列分別為，

RSIV-F3：5’-GTCACACCCGCAGACAAT-3’；

RSIV-B3：5’-ACCTCGGACAGGGGATTG-3’；

RSIV-FIP：

5’-TGCGGTGGGTGACGTTCTTTAC-TTTT-CTTGGTGCATCTGGACCTC-3’；

RSIV-BIP：

5’-ACGTGCAAAGCAATTACACCGC-TTTT-GCAAAGGCAGATTGACCTTG-3’；

RSIV-LF：5’-TTGACGGGATGACTGAACCT-3’；

RSIV-LB：5’-GGCCAGTCCCGTGTATGTCAAC-3’。

3.一種真鯛虹彩病毒檢測試劑盒，其特征在于，包括：設計好的權利要求1或2所述的特異性引物組。

4.如權利要求3所述的真鯛虹彩病毒檢測試劑盒，其特征在于：

所述試劑盒進一步包括：緩沖液Thermoplol?buffer、脫氧核糖核苷三磷酸(dNTP)、硫酸鎂溶液(MgSO₄)、甜菜堿Betaine(Sigma)、UNG酶、待檢測樣品的DNA模板以及水。

5.如權利要求3或4所述的真鯛虹彩病毒檢測試劑盒，其特征在于：所述正向外引物(F3)和所述反向外引物(B3)的濃度可以均是7μM～13μM，添加量可以均為0.3μL～0.7μL；所述正向環引物(LF)和所述反向環引物(LB)的濃度可以均是7μM～13μM，添加量可以均為0.3μL～0.7μL；所述正向內引物(FIP)和反向內引物(BIP)的濃度均可以是7μM～13μM，添加量可以均為1μL～3μL；所述脫氧核糖核苷三磷酸(dNTP)的濃度優選為5mM～15mM，添加量可以為3μL～4μL；所述10×Thermoplol?buffer的添加量可以為2μL～3μL；所述硫酸鎂溶液(MgSO₄)的濃度可以是0.05M～0.15M，添加量可以均為0.5μL～1.5μL；所述待測樣品DNA模板的添加量可以是1μL～3μL；所述甜菜堿Betaine(Sigma)的濃度可以是5M～15M，添加量可以為2μL～3μL，所述UNG酶濃度可以是0.8U/μL～1.2U/μL，添加量可以為0.4μL～0.8μL。

6.如權利要求3至5所述的真鯛虹彩病毒檢測試劑盒，其特征在于：所述試劑盒中還可以包括0.5μL～1.5μL濃度為6U/μL～10U/μL的鏈置換脫氧核糖核酸聚合酶(Bst?DNA)。

7.一種權利要求3至6的真鯛虹彩病毒檢測試劑盒的使用方法，其特征在于，包括：

第一步，待檢測樣品的DNA的提取；

第二步，將提取的DNA模板在所述試劑盒中進行環介導等溫擴增反應；

第三步，將第二步反應獲得的產物進行測定，觀察等溫擴增反應導致的變化。

8.如權利要求7所述的使用方法，其特征在于，所述第二步進一步包括：

a、以真鯛虹彩病毒主要衣殼蛋白(MCP)基因全序列為基礎，設計6條特異性引物構成的特異性引物組，建立環介導等溫擴增反應體系和反應程序；

b、將所述六條特異性引物與緩沖液Thermoplol?buffer、脫氧核糖核苷三磷酸(dNTP)、硫酸鎂溶液(MgSO4)、甜菜堿Betaine(Sigma)、UNG酶、所述第一步中提取的待檢測樣品的DNA以及水混合并加熱反應；

c、將b步驟反應的產物冷卻后加入鏈置換脫氧核糖核酸聚合酶(Bacillus?stearothermophilus?DNA?polymerase，簡稱Bst?DNA聚合酶)進一步加熱反應，獲得產物。

9.如權利要求7或8所述的使用方法，其特征在于：所述第三步中產物的檢測方法可以采用瓊脂糖凝膠電泳法或熒光染料法(SYBR?Green?I)。

10.一種真鯛虹彩病毒的環介導等溫擴增檢測方法，其特征在于：

第一步，待檢測樣品的DNA的提取；

第二步，將提取的DNA模板進行環介導等溫擴增反應；

第三步，將第二步反應獲得的產物進行測定，觀察等溫擴增反應導致的變化；

所述第二步進一步包括，

a、以真鯛虹彩病毒主要衣殼蛋白(MCP)基因全序列為基礎，PrimerExplorer?V3軟件設計6條特異性引物構成的特異性引物組，建立環介導等溫擴增反應體系和反應程序，所述6條特異性引物構成的特異性引物組分別為正向外引物(F3)、反向外引物(B3)、正向內引物(FIP)、反向內引物(BIP)、正向環引物(LF)及反向環引物(LB)，所述6條特異性引物構成的特異性引物組序列可以分別為，

RSIV-F3：5’-GTCACACCCGCAGACAAT-3’；

RSIV-B3：5’-ACCTCGGACAGGGGATTG-3’；

RSIV-FIP：

5’-TGCGGTGGGTGACGTTCTTTAC-TTTT-CTTGGTGCATCTGGACCTC-3’；

RSIV-BIP：

5’-ACGTGCAAAGCAATTACACCGC-TTTT-GCAAAGGCAGATTGACCTTG-3’；

RSIV-LF：5’-TTGACGGGATGACTGAACCT-3’；

RSIV-LB：5’-GGCCAGTCCCGTGTATGTCAAC-3’；

b、將所述六條特異性引物與緩沖液Thermoplol?buffer、脫氧核糖核苷三磷酸(dNTP)、硫酸鎂溶液(MgSO₄)、甜菜堿Betaine(Sigma)、UNG酶、所述第一步中提取的待檢測樣品的DNA以及水混合，首先加熱到40℃～60℃，反應2min～4min，隨后將溫度進一步升高至90℃～100℃，反應4min～6min；

c、將b步驟反應后的產物冷卻4min～6min，隨后加入0.5μL～1.5μL的鏈置換脫氧核糖核酸聚合酶(Bst?DNA)，進一步在60℃～65℃下反應50min～70min，隨后加熱到80℃～85℃下反應5min～15min，終止反應；

所述第三步中產物的檢測方法可以采用瓊脂糖凝膠電泳法或熒光染料法(SYBR?Green?I)；

當采用瓊脂糖凝膠電泳法檢測時，因為環介導等溫擴增反應形成各種不同長度的莖環狀結構片段，則產物經瓊脂糖凝膠電泳后可觀察到明顯梯形擴增帶，表明發生了擴增反應，若沒有觀察到梯形擴增帶，則無擴增；

當采用熒光染料法(SYBR?Green?I)時，通過在第二步獲得的產物中加入熒光染料SYBR?Green?I來肉眼判定，若發生擴增反應，則顏色變成綠色，若為橙色，則沒有發生擴增反應。