[發明專利]帶有標簽的腸道病毒71型全長感染性克隆的制備方法及應用

無效

• 申請號: 201110444377.2
• 申請日: 2011-12-23
• 公開（公告）號: CN102517317A
• 公開（公告）日: 2012-06-27
• 發明（設計）人: 張波;史佩勇;許文波;袁志明;鄧成林;商寶娣;賈凡
• 申請（專利權）人: 中國科學院武漢病毒研究所
• 主分類號: C12N15/66
• 分類號: C12N15/66;C12N15/41;C12N15/63;C12N7/01;C12Q1/70;C12Q1/02
• 代理公司: 武漢宇晨專利事務所 42001
• 代理人: 王敏鋒

技術領域

本發明屬于生物技術領域，更具體涉及一種分別帶有eGFP和DsRed標簽的腸道病毒71型全長感染性克隆的制備方法，及其在制備EV71病毒的能力及藥物篩選中的應用。?

背景技術

腸道病毒71型(Enterovirus?71，EV71)屬于小RNA病毒科(Picornaviridae)腸道病毒屬(Enterovirus)，其基因組為單股正鏈RNA，長度約為7.5kb，編碼約2200個氨基酸。基因組編碼的多聚蛋白可切割成3個前體蛋白(P1、P2、P3)。其中，P1前體蛋白可切割4種病毒結構蛋白(VP1、VP2、VP3和VP4)。P2和P3前體蛋白可切割為7個非結構蛋白(2A、2B、2C、3A、3B、3C、3D)；P3區在進化過程中高度保守。ORF的兩側分別為5’和3’非編碼區，另外在3’非編碼區末端含有一個長度可變的多聚腺苷酸(polyA)。?

EV71的感染能夠引起人的手足口病、皰疹性咽峽炎、無菌性腦膜炎、脊髓灰質炎樣麻痹等多種與神經系統相關的疾病，嚴重時可危及生命。其傳播途徑主要經由胃腸道或呼吸道傳播，也可經由接觸病人皮膚水泡的皰疹液而受到感染。自1974年，EV71被首次報道以來，已在馬來西亞、澳大利亞、新加坡、日本，中國臺灣和中國大陸等國家和地區爆發和流行。在我國，很多地區都曾有散發病例的報道，直到2008年EV71的爆發流行(手足口病病例488955例，死亡126例)，才引起了整個社會的關注。因此，2008年4月，國家衛生部頒發了《腸道病毒(EV71)感染診療指南(2008版)》和《手足口病預防控制指南(2008版)》，并在同年5月將手足口病納入丙類法定傳染病管理。2009年，我國部分地區手足口病病例呈現增多的趨勢。針對嚴峻的現狀，廣大的科學工作者以EV71為對象，從病毒的生物學特性、致病機理、診斷試劑和疫苗的研究等方面做了大量的工作。但是，目前仍然缺乏特效的治療手段。因此，繼續深入的開展相關的研究，如病毒的分子生物學特性、復制機制、致病機理等，將有利于人類更加全面透徹?的了解EV71，從而為設計有效的藥物、準確的診斷方法和試劑以及良好的疫苗提供理論依據。?

隨著分子生物學的不斷發展，科學家已經能夠通過反向遺傳學的手段來定向改造病毒，為深入開展相關的病毒學研究提供了良好的工具。目前，該技術已經應用到了許多不同的病毒研究中，如西尼羅病毒，登革病毒，狂犬病毒，牛病毒性腹瀉病毒等，建立了相應病毒的反向遺傳學平臺(全長感染性克隆)，以這些平臺為基礎開展了關于病毒的復制機制、致病機理和疫苗的相關研究，并取得了突破性的進展。同時，相關的科學工作者在構建的全長感染性克隆的基礎上進一步的設計了帶有不同標簽的全長感染性克隆。這一新的反向遺傳學平臺為開展相關的科學研究提供了相比于不帶標簽的病毒全長感染性克隆更便捷的優勢。?

因此，本發明分別獲得了帶有eGFP和DsRed標簽的EV71全長感染性克隆，為深入開展EV71的基礎研究和應用研究提供了有效的平臺。本發明具有十分重要的理論意義和現實意義，同時具有廣泛的應用前景。?

發明內容

本發明的目的在于提供了一種分別帶有綠色熒光蛋白和紅色熒光蛋白標簽的EV71型全長感染性克隆構建方法，首先建立EV71全長感染性克隆(pACYC-EV71-FL)，然后采用雙酶切的方法分別將eGFP基因和DsRed基因插入于低拷貝載體pACYC-EV71-FL中，從而分別獲得帶有eGFP標簽的EV71全長感染性克隆和帶有DsRed標簽的EV71全長感染性克隆。將獲得的EV71全長感染性克隆體外轉錄為RNA，并將其轉染Vero細胞，并通過細胞病變的觀察、eGFP的檢測、DsRed的檢測、病毒特定基因的檢測和病毒蝕斑等方法證明了分別eGFP基因和DsRed基因的EV71全長感染性克隆具有穩定產生EV71的能力，產生的EV71的生物學特性與親代病毒相似。?