[發明專利]帶有標簽的腸道病毒71型全長感染性克隆的制備方法及應用

無效

• 申請號: 201110444377.2
• 申請日: 2011-12-23
• 公開（公告）號: CN102517317A
• 公開（公告）日: 2012-06-27
• 發明（設計）人: 張波;史佩勇;許文波;袁志明;鄧成林;商寶娣;賈凡
• 申請（專利權）人: 中國科學院武漢病毒研究所
• 主分類號: C12N15/66
• 分類號: C12N15/66;C12N15/41;C12N15/63;C12N7/01;C12Q1/70;C12Q1/02
• 代理公司: 武漢宇晨專利事務所 42001
• 代理人: 王敏鋒

1.一種帶有綠色熒光蛋白和紅色熒光蛋白標簽的EV71型全長感染性克隆構建方法，其步驟是：

(1)總RNA的提取：

取140ul的EV71病毒液，按照QIAamp?Viral?RNA試劑盒說明書的要求抽提EV71的RNA；

(2)EV71的RT-PCR擴增：

根據EV71基因的特性，將該基因分為了四個部分，分別命名為F1、F2、F3和F4，以步驟(1)中的總RNA為模版，采用RT-PCR分別獲得DNA片段F1、F2、F3和F4，片段的序列為SEQ?ID?NO：1、SEQ?ID?NO：2、SEQ?ID?NO：3、SEQ?ID?NO：4所示，DNA片段F1的引物：SEQ?ID?NO：5和SEQ?ID?NO：6，DNA片段F2的引物：SEQID?NO：7和SEQ?ID?NO：8，DNA片段F3的引物：SEQ?ID?NO：9和SEQID?NO：10，DNA片段F4的引物：SEQ?ID?NO：11和SEQ?ID?NO：12，另外SEQ?ID?NO：5含有T7RNA聚合酶啟動子序列SEQ?ID?NO：13；

RT-PCR的反應體系均為：PrimeScript?1Step?Enzyme?Mix：2μl，2×1Step?Buffer：25μl，引物：1μl，引物：1μl，模板RNA為：3μl，無RNase水：18μl；擴增條件為：50℃30min，94℃2min，94℃30s，55℃30s，72℃3min，72℃10min，16℃10min，28個循環；

(3)EV71亞克隆的構建：

將步驟(2)中獲得的片段F1、F2、F3、F4分別和載體pUC19連接，并將連接產物轉化感受態HB101，PCR鑒定為陽性的克隆進行培養并抽提質粒進行測序，測序正確的克隆命名為pUC19-F1、pUC19-F2、pUC19-F3和pUC19-F4；

(4)含有EV71基因的重組克隆的構建：

用BsiwI和HindIII酶切步驟(3)中獲得的pUC19-F1和pUC19-F2，回收pUC19-F1的大片段和pUC19-F2的小片段，使用濃度為1％(w/v)瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA的質量，然后使用T4DNA連接酶連接經過回收的DNA，并將連接產物轉化感受態HB101，將PCR鑒定為陽性的克隆進行培養并抽提質粒進行測序，測序正確的克隆命名為pUC19-F1-F2；

用SpeI和HindIII酶切步驟(3)中獲得的pUC19-F3和pUC19-F4，回收pUC19-F3的大片段和pUC19-F4的小片段，使用濃度為1％(w/v)瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA的質量，然后使用T4DNA連接酶連接經過回收的DNA，并將連接產物轉化感受態HB101，將PCR鑒定為陽性的克隆進行培養并抽提質粒進行測序，測序正確的克隆命名為pUC19-F3-F4；

用AatII和HindIII酶切pUC19-F1-F2和pUC19-F3-F4，回收pUC19-F1-F2的大片段和pUC19-F3-F4的大片段的大片段，使用濃度為1％(w/v)瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA的質量，然后使用T4DNA連接酶連接經過回收的DNA，并將連接產物轉化感受態HB101，將PCR鑒定為陽性的克隆進行培養并抽提質粒進行測序，測序正確的克隆命名為pUC19-F1-F2-F3-F4；

用XbaI和HindIII酶切pUC19-F1-F2-F3-F4和pACYC177，分別使用瓊脂糖凝膠回收試劑盒回收經過酶切的pUC19-F1-F2-F3-F4和經過酶切的pACYC177，使用濃度為1％(w/v)瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA的質量，然后使用T4DNA連接酶連接經過回收的DNA，并將連接產物轉化感受態HB101，將PCR鑒定為陽性的克隆進行培養并抽提質粒進行測序，測序正確的克隆命名為pACYC-EV71-FL；

(5)分別帶有eGFP和DsRed標簽的EV71全長感染性克隆的構建：

以帶有eGFP和DsRed基因的質粒為模版，使用PrimeSTAR?HS酶，分別使用特異引物擴增eGFP和DsRed基因片段，兩種熒光標簽序列為SEQ?ID?NO：14、SEQ?ID?NO：15所示，擴增eGFP的引物為SEQ?ID?NO：16、SEQ?ID?NO：17，擴增DsRed的引物為SEQ?ID?NO：18、SEQ?ID?NO：19，使用濃度為1％(w/v)瓊脂糖凝膠電泳檢測RT-PCR產物，并使用瓊脂糖凝膠回收試劑盒分別回收DNA片斷，使用Thermo?Scientific?NanoDrop?2000測定DNA的濃度，使用濃度為1％(w/v)的瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA的質量，并于-20℃保存備用；

PCR的反應體系均為5×PS?buffer：10μl，dNTP：4μl，引物：0.5μl，引物：0.5μl，模板：0.5μl，PrimeSTAR?HS酶：0.5μl，水：34μl。擴增條件為：98℃30s，94℃10s，55℃15s，72℃1min，72℃10min，16℃10min，30個循環；

將獲得的eGFP基因片段和DsRed基因片段和步驟(4)中的pACYC177-EV71-FL分別為用SphI和MluI酶切，使用瓊脂糖凝膠回收試劑盒回收經過酶切的eGFP基因片段、DsRed基因片段和pACYC177-EV71-FL，使用濃度為1％(w/v)瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA的質量，然后使用T4DNA連接酶連接經過回收的產DNA片段，并將連接產物轉化感受態HB101，將PCR鑒定為陽性的克隆進行培養并抽提質粒進行測序，測序正確的克隆命名為pACYC177-EV71-eGFP-FL和pACYC177-EV71-DsRed-FL。