[發明專利]一種生產乙醇的光合微生物

無效

• 申請號: 201110443700.4
• 申請日: 2011-12-27
• 公開（公告）號: CN102994392A
• 公開（公告）日: 2013-03-27
• 發明（設計）人: 范文俊;鄭曉光
• 申請（專利權）人: 浙江齊成碳能科技有限公司
• 主分類號: C12N1/13
• 分類號: C12N1/13;C12N15/74;C12P7/06;C12R1/89
• 代理公司: 北京漢昊知識產權代理事務所(普通合伙) 11370
• 代理人: 黃可峻

技術領域

本發明涉及可再生能源和生物技術領域。具體涉及一種經過基因工程修飾后可通過光合作用高效生產乙醇的微生物，以及所述基因工程修飾微生物的方法和運用此基因工程微生物制備乙醇的方法。?

背景技術

進入21世紀以來，原油價格居高不下，太陽能、風能、潮汐能等開發利用成本居高不下，而各國對環境保護的要求在不斷的提高，因此，如何開發替代能源的問題受到各國普遍關注。許多國家將加快發展可再生能源作為發展替代能源的重要戰略，生物能源是其中發展最快的領域。?

目前的液體生物燃料主要有生物燃料乙醇和生物柴油。然而，生物燃料的快速發展面臨著糧食安全和土地淡水資源緊缺問題。現有技術通過燃料乙醇產業作為替代能源，但是，隨著燃料乙醇產量增加，糧食供給短缺和價格上漲導致以糧食為原料的生物能源產業不能持續性發展。?

近幾年大力發展的非糧燃料乙醇和生物質發電產業同樣受到客觀條件的制約，難以滿足大規模替代化石燃料的規模和成本要求。以木薯、甜高粱、纖維素為原料的燃料乙醇產業從本質上說是以種植業為基礎的，需要大規模投入可耕地、淡水、化肥以獲得較高產量，而這些資源均為稀缺資源，用于替代化石能源將對整體資源環境造成巨大壓力。?

因此，迫切需要開發不占用可耕地、淡水、化肥資源的新型生物能源技術，為可再生能源產業發展提供具備現實可行性的手段，切實有效減少二氧化碳排放，替代化石能源使用，促進基于化石能源的傳統工業體系向基于可再生能源的綠色工業體系轉化。?

對微生物進行基因工程改造來生產能源是能源產業中的一個發展方向。但現有技術中，工業上主要是利用具有乙醇代謝途徑的異養微生物，例如酵母和大腸桿菌等。?

發明名稱為“基因修飾酵母物種和使用基因修飾酵母的發酵方法”的中國專利200480019052.8公開了用外源木糖異構酶基因轉化酵母細胞。額外的基因修飾增強了所轉化的細胞將木糖發酵成乙醇或者其產物的能力。那些修飾包括缺失非特異或特異的醛糖還原酶基因、缺失木糖醇脫氫酶基因和/或超表達木酮糖激酶。該方法可用于燃料乙醇的生產或用于酒精飲料的生產。?

發明名稱為“大腸桿菌乙醇發酵工程菌及其應用”的中國專利200710177003.2公開了一種耐乙醇的大腸桿菌乙醇發酵工程菌。經多代的定向篩選得到了高耐乙醇的大腸桿菌突變株，并在所述突變株中轉入了運動發酵單胞菌的乙醇脫氫酶基因I?I和丙酮酸脫羧酶基因，得到了一種新型耐乙醇的大腸桿菌乙醇發酵工程菌。該工程菌在用五碳糖和六碳糖做底物發酵生產乙醇時，在高濃度乙醇下依然能夠保持較高的發酵速率，而且有較高的乙醇轉化率。?

藍藻是一種自養微生物，是目前地球上最廣泛的生物體。藍藻的細胞質中都有內膜系統。藍藻的細胞質中具原始的片層結構，片層上分布有光合色素葉綠素和藻膽素(包括藻藍素和藻紅素兩種)及類胡蘿卜素。藍藻的葉綠素可以進行光合作用，并且其細胞可以提供光合作用所需的能量，所以藍藻可以進行光合作用，產生自己所需要的物質，即可以自養。?

但是，自然存在的光合細菌藍藻通常不能利用陽光和二氧化碳合成乙醇，僅在避光和無氧條件下通過發酵產生少量乙醇。?

本領域已知生產乙醇的微生物(例如大腸桿菌，酵母菌，運動發酵單細胞菌等)中存在乙醇生產的代謝途徑。已知的乙醇生產代謝途徑是從糖酵解途徑的丙酮酸經過乙醛再到末端代謝產物乙醇，其中丙酮酸到乙醛的反應過程由丙酮酸脫羧酶(pyruvate?decarboxylase，PDC)催化，乙醛到乙醇的反應過程由乙醇脫氫酶(alcohol?dehydrogenase?2，ADHB)催化控制。藍藻的基因組中不存在丙酮酸脫羧酶基因pdc，因而不具有利用陽光和二氧化碳產生乙醇的能力。?

本發明提供了一種利用基因工程藍藻生產乙醇的方法，經過對野生藍藻的改造，從而使得藍藻能夠直接利用太陽光和二氧化碳生產乙醇。?

發明內容

本發明以藍藻為宿主，將外源乙醇代謝途徑的丙酮酸脫羧酶基因和乙醇脫氫酶基因導入藍藻，形成具有穩定遺傳性狀和較高乙醇產率的基因工程菌株，使得改造的藍藻菌株能夠利用陽光、水和二氧化碳生產乙醇。本發明還提供了基因工程藍藻通過光合作用利用陽光、水和二氧化碳制備乙醇的方法。?

本發明提供了一種利用光合作用生產乙醇的基因工程藍藻，其含有整合到染色體上的外源丙酮酸脫羧酶基因和乙醇脫氫酶基因。外源丙酮酸脫羧酶基因和乙醇脫氫酶基因在藍藻細胞內分別編碼具有丙酮酸脫羧酶活性和乙醇脫氫酶活性的蛋白。?