[發明專利]雪松疫霉的分子檢測方法及其引物

無效

• 申請號: 201110443100.8
• 申請日: 2011-12-27
• 公開（公告）號: CN102424851A
• 公開（公告）日: 2012-04-25
• 發明（設計）人: 紀睿;張正光;廖太林;李百勝;王健生
• 申請（專利權）人: 中華人民共和國昆山出入境檢驗檢疫局
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68;C12N15/11;C12R1/645
• 代理公司: 北京知本村知識產權代理事務所 11039
• 代理人: 劉江良

技術領域

本發明涉及一種用于檢測雪松疫霉的引物，以及利用所述引物檢測雪松疫霉的分子檢測方法。

背景技術

雪松疫霉根腐病菌(Phytophthora?lateralis?Tucker?et?Mibrath)引起雪松根部腐爛病。該病害1920年在美國華盛頓西雅圖里首次發現。目前該病菌廣泛分布于世界各地（Smith?I?M.?Phytophthora?lateralis[J].?EPPO?Bulletin,?2009.?39(1):43-47.）。該病害于2010年在我國臺灣省首次報道（Brasier?C?M,?Vettraino?A?M,?Chang?T?T,?et?al.?Phytophthora?lateralis?discovered?in?an?old?growth?Chamaecyparis?forest?in?Taiwan[J].?Plant?Pathology,?2010,??59(4):?595-603），大陸地區尚未發現，是一類危險性植物檢疫性病害。雪松疫霉根腐病菌不僅危害雪松，還可以侵染美國扁柏、短葉紅豆杉、美國尖葉扁柏、獼猴桃、扁柏、杜松、側柏、杜鵑花屬植物（James?W,?Claire?S.?Pest?Risk?Analysis?For?Phytophthora?lateralis[Z].2006.）。

該病害診斷困難，按常規方法分離會產生很多雜菌，影響病原菌的準確分離。同時，疫霉形態特征復雜，變異快，且P.?lateralis與其它病原菌如P.?cinnamomi、P.?gonapodyides難以分離（Torgeson?D?C,?Young?R?A,?Milbrath?J?A.?Phytophthora?root?rot?diseases?of?Lawson?cypress?and?other?ornamentals[M].?Agricultural?Experiment?Station,??Oregon?State?College,?1954）。因此，常規的病害診斷技術難以快速準確鑒定該病原菌。隨著分子生物學技術的發展，國內外對很多疫霉的分子檢測進行了不少研究。現已證明，由于tRNA序列在真菌(卵菌)種間高度變異、而在種內穩定，因此該序列為病原菌的分子檢測提供了理想的靶序列。

發明內容

本發明所要解決的技術問題是提供一種雪松疫霉的分子檢測方法及其引物，利用該引物及檢測方法檢測雪松疫霉，速度快、準確、靈敏度高、穩定可靠。

本發明提供的技術方案是：一種用于檢測雪松疫霉的引物，其上游引物序列如SEQ?ID?No.1所述，下游引物序列如SEQ?ID?No.2所述。???

一種檢測雪松疫霉的試劑盒，該試劑盒包含上述的引物。?

一種利用上述引物檢測雪松疫霉的方法，其過程是：提取待測樣品的DNA作為模板，利用所述的引物進行PCR反應，取PCR反應擴增產物進行檢測，如果存在分子量約為192bp的DNA條帶，則證明所檢樣品中含有雪松疫霉。

上述的檢測雪松疫霉的方法，進一步地，所述PCR反應的擴增體系為：10.0?μL?SYBR?Premix?Ex?TaqTM(2×)，0.4?μL?ROX?Reference?Dye?II(50×)，引物(10?μmol/L)各0.4?μL，模板2?μL，用滅菌水補足體積至20?μL。

所述的檢測雪松疫霉的方法，所述PCR反應的反應程序為：94°C預變性30?s；94°C變性5?s，46°C退火34?s，40個循環；95°C?15?s，60°C?1?min，?95°C?15?s，60°C?15?s。

?進一步地，為提高檢測雪松疫霉的靈敏度，本發明還提供另一種用于檢測雪松疫霉的引物，包括兩對引物，即：第一對引物其上游引物核苷酸序列如SEQ?ID?No.1所述，下游引物核苷酸序列如SEQ?ID?No.2所述，第二對引物其上游引物核苷酸序列如SEQ?ID?No.3所述，下游引物核苷酸序列如SEQ?ID?No.4所述。?

本發明還提供另一種檢測雪松疫霉的試劑盒，其包含上述的第一對引物和和第二對引物。