[發(fā)明專利]一種利用SSR分子標(biāo)記技術(shù)快速鑒定柳枝稷雜交種的方法

無(wú)效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201110442587.8
• 申請(qǐng)日: 2011-12-27
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN102703579A
• 公開(kāi)（公告）日: 2012-10-03
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 黃琳凱;張新全;張婧;曾兵
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 四川農(nóng)業(yè)大學(xué)
• 主分類號(hào): C12Q1/68
• 分類號(hào): C12Q1/68
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• 代理人: 暫無(wú)信息

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及一種利用SSR分子標(biāo)記技術(shù)快速鑒定柳枝稷雜交種的方法，域。

背景技術(shù)

柳枝稷(Panicum?virgatum)是禾本科黍?qū)僦参铮仓旮叽螅哂羞m應(yīng)性好，耐貧瘠和對(duì)環(huán)境友好等優(yōu)點(diǎn)，現(xiàn)在被作為是纖維素類能源植物中的首選植物。但其育種水平落后，分子育種可以大大加快其育種進(jìn)程。雜種鑒定是遺傳育種的基礎(chǔ)工作，鑒定的真雜種可以為構(gòu)建遺傳圖譜提供重要依據(jù)。柳枝稷是異花授粉植物，存在一定的自交率，如何快速準(zhǔn)確鑒定出柳枝稷雜交后代的真實(shí)性是遺傳育種的基礎(chǔ)工作。

除形態(tài)學(xué)鑒定外，分子標(biāo)記技術(shù)被廣泛運(yùn)用于雜交后代的真實(shí)性鑒定。例如在文獻(xiàn)《結(jié)縷草屬植物雜交后代雜種真實(shí)性鑒定-SRAP分子標(biāo)記》中報(bào)道的雜種鑒定的方法，利用9對(duì)具有父本特征帶的引物組合對(duì)結(jié)縷草交后代的DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增反應(yīng)。電泳分離擴(kuò)增產(chǎn)物后，具有父本特征帶的后代為真雜種，若無(wú)，則利用其他引物繼續(xù)鑒定。

在《結(jié)縷草屬植物雜交后代雜種真實(shí)性鑒定-SRAP分子標(biāo)記》一文中，為鑒定37個(gè)雜交后代的雜種真實(shí)性，篩選了9對(duì)具有父本特征帶的SRAP引物，利用這些引物對(duì)雜交后代DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，電泳分離擴(kuò)增產(chǎn)物，具有父本特異條帶的雜交種為真雜種。若沒(méi)有擴(kuò)增出父本特異條帶，則更換引物擴(kuò)增。最終共利用9對(duì)引物鑒定出雜交后代中有32個(gè)為真雜種。如圖1所示。

03-2，03-4，03-5，03-6，03-7，03-8，03-9，03-10和03-11是以022為母本，123為父本的雜交后代。圖中箭頭所指接近300bp的條帶為父本特異條帶。則03-2，03-4，03-5，03-7，03-9和03-11具有父本特異條帶，為真雜種。其余雜交后代需利用其他引物繼續(xù)鑒定。

SRAP分子標(biāo)記技術(shù)屬于顯性標(biāo)記，若后代具有父本特異條帶，則能肯定雜交后代是真雜種，若不具有父本特異條帶，則不能立即判定其為假雜種，需要用其余引物繼續(xù)鑒定。花費(fèi)時(shí)間較多，成本較高。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明所要解決的技術(shù)問(wèn)題是針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)的不足提供一種利用SSR分子標(biāo)記技術(shù)快速鑒定柳枝稷雜交種的方法。

一種利用SSR分子標(biāo)記技術(shù)快速鑒定柳枝稷雜交種的方法，包括以下步驟：

A1，基因組DNA提取：

以待鑒定的柳枝稷植株幼葉或種子為材料，采用植物基因組DNA提取試劑盒提取DNA；提取的DNA用0.8％的瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行純度的檢測(cè)；將DNA樣品置于-20℃冰箱保存；待開(kāi)始實(shí)驗(yàn)時(shí)，將各個(gè)DNA樣品取出一部分稀釋至20ng/μL，放于4℃冰箱保存并使用；

A2，SSR分析：

利用篩選得到的柳枝稷EST-SSR標(biāo)記引物：

primer1-F：5’-AGTTTGAGCTTTGTGTTTTTG-3’，

primer1-R：5’-CAACAATTTGGTTTCAACAAG-3’；

進(jìn)行雜種鑒定；PCR反應(yīng)擴(kuò)增體系20μL：DNA?2μL(20ng/μL)，2×Taq?PCRMasterMix?10μL，上下游引物各1μL(10μmol/L)，滅菌水補(bǔ)齊20μL；

EST-SSR?PCR反應(yīng)程序?yàn)椋?4℃預(yù)變性5min；94℃變性1min，52℃退火1min，72℃延伸1.5min，共35個(gè)循環(huán)；最后72℃延伸10min，4℃保存。

電泳分離：最后PCR擴(kuò)增產(chǎn)物采用1.8％的MetaPhor瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳分離，0.1mg/mL的溴化乙錠染色，120V電壓在0.5×TBE緩沖液中電泳約1.5h，電泳結(jié)束后凝膠在凝膠成像系統(tǒng)中照相并保存；或者用PCR擴(kuò)增產(chǎn)物在6％的聚丙烯酰胺凝膠(丙烯酰胺∶甲叉＝19∶1，7.5mol/L尿素，1×TBE緩沖液)上用1×TBE緩沖液進(jìn)行垂直電泳分離。首先在正極緩沖液中加入EB(終濃度：0.75μg/ml)，用300伏電壓跑45分鐘，然后點(diǎn)樣，300伏電壓跑2小時(shí)。電泳結(jié)束后凝膠在凝膠成像系統(tǒng)(Bio-rad)中照相并保存。

A3，雜種鑒定：在雜交后代的擴(kuò)增產(chǎn)物中，若具有父本特異條帶，則為真雜種，反之，則為假雜交種。