[發明專利]低免疫原性抗腫瘤溶栓雙效嵌合蛋白及其制備方法和應用

有效

• 申請號: 201110441070.7
• 申請日: 2011-12-26
• 公開（公告）號: CN102492043A
• 公開（公告）日: 2012-06-13
• 發明（設計）人: 胡風慶;崔小進;林家帥
• 申請（專利權）人: 遼寧大學
• 主分類號: C07K19/00
• 分類號: C07K19/00;C12N15/70;A61K38/45;A61K38/16;A61P35/00;A61P7/02
• 代理公司: 沈陽杰克知識產權代理有限公司 21207
• 代理人: 金春華

技術領域

本發明涉及低免疫原性抗腫瘤溶栓雙效嵌合蛋白及其制備方法和應用，屬于微生物學，分子生物學和基因工程領域。?

背景技術

2009年，美國ASCO主席在介紹腫瘤進展時提到，癌癥的第一死亡原因是癌癥本身和癌癥復發，第二位死因就是血栓。癌癥與血栓的關系非常密切，重視癌癥血栓的預防和治療已成為臨床醫生今后工作的重點之一。

1865年，法國醫生Armand?Trousseau?首次報道了胃癌患者容易形成靜脈血栓，不久，Billroth又于1878年發現了血栓中存在癌細胞，進一步提出癌變可引起凝血功能紊亂。臨床上把腫瘤相關性血栓稱為Trousseau綜合癥。大量的病理、實驗和臨床研究證實了這一現象，而且還發現，幾乎所有的癌癥患者都存在局部或全部高凝狀態。

癌癥患者的血栓性疾病包括深靜脈血栓(deep?venous?thlmmbosis，DVT)、肺栓塞(pulmonary?embolism，PE)、彌散性血管內凝血(disseminated?intravascular?coagulation，DIC)、門靜脈血栓(portal?vein?thmrnbosis，PVT)和動脈血栓栓塞(arterial?thromboembolism，AT)、游走性淺表血栓性靜脈炎(migratory?thrombophlebitis?superficial)等，其中下肢DVT最為常見。

癌癥患者血栓形成的發病機理相當復雜，至今尚未完全明確。多種因素通過不同途徑共同導致了癌癥患者的血栓易患傾向，主要包括抗癌治療、腫瘤細胞的表達物及釋放物和致癌基因等因素。

抗癌治療導致血栓形成，主要是手術治療期間形成血栓，化療藥物和放射治療誘發血栓形成以及患者在接受中心靜脈穿刺置管治療期間，管周纖維蛋白鞘導致血栓形成。

癌癥患者所患的血栓性疾病與腫瘤細胞表達和釋放的物質關系密切。腫瘤細胞可通過釋放促凝因子或炎性因子來直接或間接地激活凝血級聯反應，另一方面，炎性因子亦可刺激腫瘤細胞釋放更多的促凝因子而加劇血液的高凝狀態。腫瘤細胞表達和釋放的三種主要促凝物質為：組織因子（TF）、癌促凝物質（cancer?procoagulant?CP）和絲氨酸蛋白酶（hepsin）。

新近的研究表明，某些致癌基因在促進細胞惡變的同時也能夠引起凝血功能紊亂。如Yu?J等證實，導致癌癥產生的某些基因病變如Ras基因活化或p53基因失活能夠造成組織因子（TF）的過度表達，誘發凝血病變。

最近的研究還顯示，血栓形成參與了腫瘤的進展、血管生成和轉移等機制。除了癌癥治療形成血栓可視為外界因素外，其余兩種因素所形成的血栓都是應機體癌變出現的。研究發現，血栓的形成有利于腫瘤發生和發展的機制可能是纖維蛋白沉積于腫瘤細胞周圍為腫瘤生長提供了2個便利條件：一方面為腫瘤細胞附著提供了基質，利于其局部擴散和蔓延；另一方面，纖維蛋白凝血塊和相關的凝血因子能夠上調血管內皮細胞生長因子的表達（VEGF），從而為新生血管創造了條件。

金黃色葡萄球菌腸毒素C2(staphylococcal?enterotoxins,?SEC2)是一類細菌超抗原，它們無需抗原遞呈細胞(antigen?presenting?cells,?APCs)的加工，也不受組織相容性復合體(MHC)的限制，在APC之外與T細胞受體Vβ鏈形成MHCII-SE-TCRVβ復合物，在極低濃度時就能刺激大部分有TCRVβ序列的T細胞增殖，使之釋放多種細胞因子，產生極強的免疫應答效應。SEC2可對腫瘤細胞產生超抗原依賴的細胞毒作用(Sag-dependent?cell-mediated?T-cell-derived?cytotoxicity,?SDCC)，從而產生系統的抗腫瘤反應。但作為潛在胃腸毒素，SEC2可引起食物中毒，引發腹絞痛和腹瀉，作為外源蛋白，SEC2分子量大，易引起超敏反應。N端17個氨基酸以及C端132個氨基酸缺失的ΔSEC2分子量小，毒副作用降低，而其抗腫瘤活性得以保持。

葡激酶(staphylokinase,?Sak)是由具有溶原性的金黃色葡萄球菌在指數期后期產生、分泌的一種胞外蛋白。葡激酶的溶栓作用機制是激活體內溶栓系統，即通過激活纖溶酶原(Plg)轉變成纖溶酶(Pli)，而起到溶解血栓的作用，是典型的第三代溶栓藥物，同其它的溶栓藥物比較，葡激酶具有溶栓活力強，溶栓作用專一，免疫原性低以及過敏反應少等多種特點，而且當血栓被溶解后，葡激酶對纖溶酶原的激活作用會受到人體內α2抗纖溶酶的抑制，避免了出血反應。并且N端缺失10個氨基酸的ΔSAK的抗血栓活性與SAK的活性相似。