[發明專利]低免疫原性抗腫瘤溶栓雙效嵌合蛋白及其制備方法和應用

有效

• 申請號: 201110441070.7
• 申請日: 2011-12-26
• 公開（公告）號: CN102492043A
• 公開（公告）日: 2012-06-13
• 發明（設計）人: 胡風慶;崔小進;林家帥
• 申請（專利權）人: 遼寧大學
• 主分類號: C07K19/00
• 分類號: C07K19/00;C12N15/70;A61K38/45;A61K38/16;A61P35/00;A61P7/02
• 代理公司: 沈陽杰克知識產權代理有限公司 21207
• 代理人: 金春華

1.低免疫原性抗腫瘤溶栓雙效嵌合蛋白，其特征在于：所述的嵌合蛋白為氨基酸序列如SEQ?ID?NO.11所示的嵌合蛋白ΔSak-ΔSEC2，或氨基酸序列如SEQ?ID?NO.12所示的嵌合蛋白ΔSEC2?–ΔSak。

2.一種利用大腸桿菌表達系統生產權利要求1所述的低免疫原性抗腫瘤溶栓雙效嵌合蛋白ΔSak-ΔSEC2的方法，其特征在于步驟如下：

1）構建載體pET?28a-Δsak-?linker-Δsec2，Δsak-?linker-Δsec2的DNA序列如SEQ?ID?NO.5所示；

2）將得到的載體pET?28a-Δsak-?linker-Δsec2經???PCR去除Δsak和Δsec2之間的linker，構建出表達嵌合蛋白ΔSak-ΔSEC2的質粒pET28a-Δsak?-Δsec2，Δsak?-Δsec2的DNA序列如SEQ?ID?NO.7所示；

3）將質粒pET28a-Δsak?-Δsec2轉入大腸桿菌BL21感受態細胞中，得到重組大腸桿菌；

4）將重組大腸桿菌接種于LB培養基中進行搖瓶培養，當菌液吸光度值達到0.6時，在30℃條件下用1?mM?IPTG誘導4～5小時，之后離心收集菌體細胞；

5）用超聲波破碎菌體細胞，功率：200-300?W；處理時間：6×9?sec，9?sec間隔；處理后，6000?rpm離心10?min，去除不溶性細胞碎片，收集上清液；

6）將上清液過Ni-NTA親和層析柱，經梯度洗脫和濃縮除鹽，得到嵌合蛋白His-ΔSak-ΔSEC2，其氨基酸序列如SEQ?ID?NO.9所示；

7）嵌合蛋白His-ΔSak-ΔSEC2經過腸激酶切割，再次過Ni-NTA親和層析柱，得到嵌合蛋白ΔSak-ΔSEC2，其氨基酸序列如SEQ?ID?NO.11所示。

3.一種利用大腸桿菌表達系統生產權利要求1所述的低免疫原性抗腫瘤溶栓雙效嵌合蛋白ΔSEC2?–ΔSak的方法，其特征在于步驟如下：

1）構建載體pET?28a-Δsec2-?linker-Δsak，Δsec2-?linker-Δsak的DNA序列如SEQ?ID?NO.6所示；

2）將得到的載體pET?28a-Δsec2-?linker-Δsak經???PCR去除Δsec2和Δsak之間的linker，構建出表達嵌合蛋白ΔSEC2-ΔSak的質粒pET28a-Δsec2?-Δsak，Δsec2?-Δsak的DNA序列如SEQ?ID?NO.8所示；

3）將質粒pET28a-Δsec2?-Δsak轉入大腸桿菌BL21感受態細胞中，得到重組大腸桿菌；

4）將重組大腸桿菌接種于LB培養基中進行搖瓶培養，當菌液吸光度值達到0.6時，在30℃條件下用1?mM?IPTG誘導4～5小時，之后離心收集菌體細胞；

5）用超聲波破碎菌體細胞，功率：200-300?W；處理時間：6×9?sec，9?sec間隔；處理后，6000?rpm離心10?min，去除不溶性細胞碎片，收集上清液；

6）將上清液過Ni-NTA親和層析柱，經梯度洗脫和濃縮除鹽，得到嵌合蛋白His-ΔSEC2-ΔSak，其氨基酸序列如SEQ?ID?NO.10所示；

7）嵌合蛋白His-ΔSEC2-ΔSak經過腸激酶切割，再次過Ni-NTA親和層析柱，得到嵌合蛋白ΔSEC2-ΔSak，其氨基酸序列如SEQ?ID?NO.12所示。

4.權利要求1所述的低免疫原性嵌合蛋白在制備抗腫瘤溶栓藥物中的應用。