[發明專利]人血清糖化白蛋白檢測試劑盒

有效

• 申請號: 201110440865.6
• 申請日: 2011-12-26
• 公開（公告）號: CN102565420A
• 公開（公告）日: 2012-07-11
• 發明（設計）人: 鄒炳德;鄒繼華;賈江花;沃燕波;徐秀芬
• 申請（專利權）人: 寧波美康生物科技股份有限公司
• 主分類號: G01N33/68
• 分類號: G01N33/68
• 代理公司: 寧波市鄞州甬致專利代理事務所(普通合伙) 33228
• 代理人: 李迎春

技術領域

本發明涉及醫學檢驗技術領域，具體涉及一種人血清糖化白蛋白檢測試劑盒。

背景技術

糖尿病是由遺傳因素、免疫功能紊亂、微生物感染及其毒素、自由基毒素、精神因素等各種致病因子作用于機體導致胰島功能減退、胰島素抵抗等而引發的糖、蛋白質、脂肪、水和電解質等一系列代謝紊亂綜合征，是危害人類疾病的幾大疾病之一。

人體血清中白蛋白占血清蛋白的66％，其余為免疫球蛋白；血清中葡萄糖與血清蛋白的N-末端發生非酶促的糖基化反應，生成糖化血清蛋白，而糖化白蛋白則占糖化血清蛋白的90％以上。另外，由于白蛋白在血清中含量穩定存在，而球蛋白則會由于感染等疾病因素造成波動；故準確測定糖化白蛋白對準確反應糖尿病的的血糖控制情況非常重要。

所以如何能精確地測定出人血清中的糖化白蛋白量成為臨床檢測糖化白蛋白的關鍵。目前市場主要采用酶法用于檢測人血清中的糖化白蛋白，其反應原理為首先使用蛋白酶將糖化蛋白消化成低分子量的糖化多肽，隨后使用果糖氨基酸酶催化糖化多肽發生氧化反應生成多肽(或氨基酸)、葡萄糖醛酮和H₂O₂，釋放的H₂O₂通過終點反應比色法來測定，其在600nm處的吸收值與糖化白蛋白的濃度成比例。具體反應過程如下：

而目前市場上的酶法糖化白蛋白存在下述缺陷：

(1)不能完全排除球蛋白的干擾：所采用的蛋白酶底物特異性差，對血清中所有蛋白種類都可以進行分解，故無法排除球蛋白的干擾；

(2)試劑盒穩定性差：因為偶聯為Trinder反應，而該反應易受到還原性物質的干擾，由于目前大量輸入抗壞血酸等還原性物質的緣故，很多病人血清中高的還原物質對反應造成很大的干擾；而去除抗壞血酸所采用的抗壞血酸氧化酶又容易受到蛋白酶的分解；蛋白酶自身也可以發生自分解反應，穩定性差；

(3)試劑盒成本高：為了將糖化白蛋白完全分解為糖化氨基酸，以便參與下步反應，故采用高濃度的蛋白酶，所采用的酶量也很高，故導致試劑盒整體成本很高；

(4)目前市場上現有的糖化白蛋白沒有給出參考范圍，只給出糖化白蛋白/白蛋白的參考范圍，對于臨床的指導有一定的缺陷。

發明內容

本發明所要解決的技術問題是提供一種人血清糖化白蛋白檢測試劑盒，該試劑盒能排除人血清中球蛋白及抗壞血酸的干擾、穩定性好、成本低。

本發明所采用的技術方案為：

一種人血清糖化白蛋白檢測試劑盒，該試劑盒包括試劑1和試劑2，其中：

試劑1：

試劑2：

其中，所述蛋白酶共表達體指將蛋白酶的基因與抗壞血酸氧化酶的基因克隆到同一載體上，然后將該載體轉化宿主菌，在同一宿主菌中實現小分子的蛋白酶與大分子的抗壞血酸氧化酶的共表達，而得到的含有蛋白酶、抗壞血酸氧化酶這兩種酶的蛋白質。

所述蛋白酶的基因可以為任一來源的包含有蛋白酶基因序列的基因，優選為曲霉屬或芽孢桿菌屬或麥軸梗霉屬來源的基因，進一步優選為酶活力高的林伯氏白色念球菌(Tritirachium?album?libmer)來源的基因，得到的蛋白酶為蛋白酶K(Proteinase?K)。從NCBI的GENBANK上可以找到該酶的全基因序列。

所述抗壞血酸氧化酶的基因可以為任一來源的包含有抗壞血酸氧化酶基因序列的基因，優選為植物來源的基因，進一步優選為黃瓜(Cucumis?sp.)來源的基因。從NCBI的GENBANK上可以找到該酶的全基因序列。

表達體系可以采用原核或真核表達體系，只要其能實現正確表達即可，優選原核表達體系，因為原核表達體系的背景較為簡單，且周期較短。

所述蛋白酶共表達體表達出的蛋白酶和抗壞血酸氧化酶的N端均有5-30個氨基酸片段的增加，即在分子克隆的時候在兩者序列的5’端均加入15-90bp的核苷酸序列(對應5-30個氨基酸)，這些氨基酸的主要功能為：

1、方便兩種酶的連接，包括酶切位點等；

2、確保兩種酶正確構象的形成，從而保證兩種酶的活力；

3、增強蛋白酶針對白蛋白的特異性；

4、避免蛋白酶對抗壞血酸氧化酶的分解作用；

5、加入合適的標簽，便于后期的分離純化。

所述緩沖液為三羥甲基氨基甲烷鹽酸鹽緩沖液、乙酸-乙酸鈉緩沖液、鄰苯二甲酸-鹽酸緩沖液或甘氨酸-鹽酸緩沖液中的一種。