[發明專利]犬星狀病毒的半套式RT-PCR檢測方法

無效

• 申請號: 201110440713.6
• 申請日: 2011-12-23
• 公開（公告）號: CN102559927A
• 公開（公告）日: 2012-07-11
• 發明（設計）人: 崔立;朱愛玲;楊曦;華修國
• 申請（專利權）人: 上海交通大學
• 主分類號: C12Q1/70
• 分類號: C12Q1/70;C12Q1/68;C12R1/93
• 代理公司: 上?？剖⒅R產權代理有限公司 31225
• 代理人: 楊元焱

1.一種犬星狀病毒的半套式RT-PCR檢測方法，其特征在于：將檢測樣品進行預處理后，提取總RNA；將總RNA逆轉錄到cDNA；通過半套式RT-PCR反應獲得擴增產物；取擴增產物進行瓊脂糖凝膠電泳鑒定；若檢測樣品在預定分子量大小的位置出現特異性擴增條帶，則判定為陽性，否則為陰性。

2.根據權利要求1所述的犬星狀病毒的半套式RT-PCR檢測方法，其特征在于：所述的半套式RT-PCR反應的引物設計如下：

外套引物：上游引物P1?L5′-CAANTCACAACCCAAAACAAA-3′；

下游引物P2?L5′-CATTCACTTGGTCAAACACAGTC-3′；

內套引物：上游引物P1?L5′-CAANTCACAACCCAAAACAAA-3′；

下游引物P3?R5′-TTTTNACNATCACTGCTAGNGA-3′。

3.如權利要求1或2所述的犬星狀病毒的半套式RT-PCR檢測方法，其特征在于：具體包括以下步驟：

A、樣品總RNA的提取

將樣品懸浮于PBS溶液中，取200ul樣品懸液上清先通過一個孔徑為0.45ul的過濾器進行過濾以除去真核、細菌大小的粒子，然后向樣品懸液上清中加入1mL?Trizol，室溫靜置10min，使核蛋白復合物完全變性；再加入200ul氯仿，劇烈震蕩15s，在室溫靜置10min，后于4℃?12000rpm離心10min，取上清0.75mL轉移到EP管中，加入0.75mL異丙醇，室溫靜置5-10min，后于4℃?12000rpm離心10min，移去上清，加入1mL?75％酒精清洗沉淀，后于4℃7500rpm離心5min，棄去酒精，得到含有樣品的總RNA的沉淀，將含有樣品的總RNA的沉淀于室溫干燥3-5min，加入30ul?DEPC水；

B、cDNA的合成

采用試劑盒將總RNA逆轉錄到cDNA：提取的總RNA?5ul、Anchored?Oligo(dT)18?1ul、2×Reaction?Buffer10ul、TransScript?RT?Enzyme?Mix?1ul和RNase-free?Water?3ul混勻，42℃孵育30min，85℃加熱5min失活反轉錄酶，得到cDNA，置于-20℃備用；

C、PCR擴增

外套PCR擴增以1.0ul?cDNA為模板，引物使用P1、P2，先95℃預變性5min；緊接著94℃40s、54℃30s、72℃40s，循環30次；再72℃延伸10min，4℃保存；內套PCR擴增以1.0ul外套PCR反應產物為模板，引物使用P1、P3，先95℃預變性5min；緊接著94℃40s、56℃30s、72℃40s，循環30次；再72℃延伸10min，得到PCR擴增產物，4℃保存。

D、電泳鑒定

取5ulPCR擴增產物，用1％瓊脂糖凝膠電泳，紫外燈下觀察擴增結果，與2000bp標準分子量對照，如在480bp處出現特異性擴增條帶，則判定檢測結果為陽性，否則為陰性。

4.如權利要求3所述的犬星狀病毒的半套式RT-PCR檢測方法，其特征在于：步驟C中所述的外套PCR擴增和內套PCR擴增所用的試劑均為5ul?10×buffer、5.0ul?10mM?dNTP、3.0ul?25mmol/LMgCl₂、0.5ul?5U/ulTaq酶、1.2ul?10umol/L上游引物、1.2ul?10umol/L下游引物和33.1ul滅菌雙蒸水。