[發(fā)明專利]犬星狀病毒的半套式RT-PCR檢測方法

無效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201110440713.6
• 申請日: 2011-12-23
• 公開（公告）號: CN102559927A
• 公開（公告）日: 2012-07-11
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 崔立;朱愛玲;楊曦;華修國
• 申請（專利權(quán)）人: 上海交通大學(xué)
• 主分類號: C12Q1/70
• 分類號: C12Q1/70;C12Q1/68;C12R1/93
• 代理公司: 上海科盛知識產(chǎn)權(quán)代理有限公司 31225
• 代理人: 楊元焱

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及生物技術(shù)，具體涉及一種犬星狀病毒的半套式RT-PCR檢測方法。

背景技術(shù)

星狀病毒是無囊膜的單股正鏈RNA病毒，呈五角或六角的星形，屬于星狀病毒科。星狀病毒于1975年首次由Madeley和Cosgrove等用電鏡檢測胃腸炎患兒糞便中發(fā)現(xiàn)。犬星狀病毒最早是在1980年時Willians用電鏡觀察腹瀉犬糞便時發(fā)現(xiàn)的。星狀病毒可引起人類、犬、貓、水豹等多種動物嘔吐、腹瀉、發(fā)熱等癥狀，特別是嬰幼兒、幼齡動物、老人以及免疫功能低下者。目前，世界各地均已有星狀病毒感染的報道，在志愿者和自然感染者的研究中均已證實星狀病毒感染與腹瀉密切相關(guān)。

星狀病毒早期檢測是以電鏡觀察和酶聯(lián)免疫技術(shù)為基礎(chǔ)，近年來隨著分子生物學(xué)技術(shù)的應(yīng)用，RT-PCR方法成為檢測星狀病毒的重要手段，但它們在特異性、敏感性等方面都存在一定的局限性。為此，本研究根據(jù)套式RT-PCR原理，建立了一種快速、準(zhǔn)確、特異的犬星狀病毒檢測方法，為臨床癥狀中的星狀病毒的快速診斷及其隱性感染的診斷提供基礎(chǔ)。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的，在于克服現(xiàn)有技術(shù)的不足之處，提供一種犬星狀病毒的半套式RT-PCR檢測方法。

本發(fā)明的技術(shù)方案是：一種犬星狀病毒的半套式RT-PCR檢測方法是，將檢測樣品進行預(yù)處理后，提取總RNA；將總RNA逆轉(zhuǎn)錄到cDNA；通過半套式RT-PCR反應(yīng)獲得擴增產(chǎn)物；取擴增產(chǎn)物進行瓊脂糖凝膠電泳鑒定；若檢測樣品在預(yù)定分子量大小的位置出現(xiàn)特異性擴增條帶，則判定為陽性，否則為陰性。

所述的半套式RT-PCR反應(yīng)的引物設(shè)計如下：

外套引物：上游引物P1?L5′-CAANTCACAACCCAAAACAAA-3′；

下游引物P2?L5′-CATTCACTTGGTCAAACACAGTC-3′；

內(nèi)套引物：上游引物P1?L5′-CAANTCACAACCCAAAACAAA-3′；

下游引物P3?R5′-TTTTNACNATCACTGCTAGNGA-3′。

上述犬星狀病毒的半套式RT-PCR檢測方法具體包括以下步驟：

A、樣品總RNA的提取

將樣品懸浮于PBS溶液中，取200ul樣品懸液上清先通過一個孔徑為0.45ul的過濾器進行過濾以除去真核、細(xì)菌大小的粒子，然后向樣品懸液上清中加入1mL?Trizol，室溫靜置10min，使核蛋白復(fù)合物完全變性；再加入200ul氯仿，劇烈震蕩15s，在室溫靜置10min，后于4℃?12000rpm離心10min，取上清0.75mL轉(zhuǎn)移到EP管中，加入0.75mL異丙醇，室溫靜置5-10min，后于4℃?12000rpm離心10min，移去上清，加入1mL?75％酒精清洗沉淀，后于4℃?7500rpm離心5min，棄去酒精，得到含有樣品的總RNA的沉淀，將含有樣品的總RNA的沉淀于室溫干燥3-5min，加入30ul?DEPC水；

B、cDNA的合成

采用試劑盒將總RNA逆轉(zhuǎn)錄到cDNA：提取的總RNA?5ul、Anchored?Oligo(dT)18?1ul、2×Reaction?Buffer10ul、TransScript?RT?Enzyme?Mix?1ul和RNase-free?Water?3ul混勻，42℃孵育30min，85℃加熱5min失活反轉(zhuǎn)錄酶，得到cDNA，置于-20℃?zhèn)溆茫?/p>

C、PCR擴增

外套PCR擴增以1.0ul?cDNA為模板，引物使用P1、P2，先95℃預(yù)變性5min；緊接著94℃40s、54℃30s、72℃40s，循環(huán)30次；再72℃延伸10min，4℃保存；內(nèi)套PCR擴增以1.0ul外套PCR反應(yīng)產(chǎn)物為模板，引物使用P1、P3，先95℃預(yù)變性5min；緊接著94℃40s、56℃30s、72℃40s，循環(huán)30次；再72℃延伸10min，得到PCR擴增產(chǎn)物，4℃保存。

D、電泳鑒定

取5ulPCR擴增產(chǎn)物，用1％瓊脂糖凝膠電泳，紫外燈下觀察擴增結(jié)果，與2000bp標(biāo)準(zhǔn)分子量對照，如在480bp處出現(xiàn)特異性擴增條帶，則判定檢測結(jié)果為陽性，否則為陰性。

步驟C中所述的外套PCR擴增和內(nèi)套PCR擴增所用的試劑均為5ul?10×buffer、5.0ul?10mM?dNTP、3.0ul?25mmol/LMgCl₂、0.5ul?5U/ulTaq酶、1.2ul?10umol/L上游引物、1.2ul?10umol/L下游引物和33.1ul滅菌雙蒸水。