[發(fā)明專利]豬FLJ小干擾RNA表達(dá)載體的構(gòu)建、鑒定法及用途

無效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201110440124.8
• 申請(qǐng)日: 2011-12-25
• 公開（公告）號(hào): CN102517328A
• 公開（公告）日: 2012-06-27
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 汪以真;伍婷;袁章琴
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 浙江大學(xué)
• 主分類號(hào): C12N15/85
• 分類號(hào): C12N15/85;C12N15/66;C12Q1/68
• 代理公司: 杭州中成專利事務(wù)所有限公司 33212
• 代理人: 金祺

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及一種豬FLJ基因小干擾RNA(siRNA)有效表達(dá)載體的構(gòu)建、鑒定及用途，屬于生物和現(xiàn)代農(nóng)業(yè)技術(shù)領(lǐng)域的應(yīng)用技術(shù)。

背景技術(shù)

FLJ基因是本課題組通過基因芯片技術(shù)篩選獲得的與豬肌內(nèi)脂肪沉積密切相關(guān)的新基因。人類FLJ是2003年測(cè)序篩選出來的新基因，功能尚未確定。本本課題組根據(jù)豬FLJ基因已知的EST序列，通過RACE技術(shù)，克隆得到FLJ全長(zhǎng)cDNA序列，F(xiàn)LJ基因全長(zhǎng)cDNA序列有2793bp(GenBank登錄號(hào)EU030283)，其中包括283bp?5′非編碼區(qū)(5′-untranslated?region，5′-UTRs)、714bp編碼區(qū)(coding?region，CDs)和1796bp的3′非編碼區(qū)(3′-UTR)，編碼區(qū)翻譯237個(gè)氨基酸(GenBank登錄號(hào)ABS29571)；BLAST結(jié)果表明，F(xiàn)LJ氨基酸序列序列與人、鼠同源性分別達(dá)到99％，84％。這為后續(xù)研究FLJ基因的功能奠定分子生物學(xué)基礎(chǔ)。

RNA干擾(RNAi)技術(shù)作為一種新的基因阻斷技術(shù)，具有低成本、高效性及高特異性等特點(diǎn)，能特異、高效地抑制特定基因的表達(dá)，已經(jīng)成為研究基因功能的一種有力工具。由于干擾載體pSilencer?4.1-CMV?neo可以方便用于目的基因siRNA表達(dá)載體的構(gòu)建，從而可以特異性的使特定目的基因沉默，功能喪失，因此干擾載體pSilencer?4.1-CMV?neo可以作為一種強(qiáng)有力的研究工具，用于功能基因組的研究。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是提供一種豬FLJ有效小干擾RNA表達(dá)載體，以及該小干擾RNA表達(dá)載體的用途。

為了解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明提供一種豬FLJ有效小干擾RNA表達(dá)載體的構(gòu)建方法，包括以下步驟：

1)、根據(jù)載體的信息和靶序列設(shè)計(jì)(并合成)3對(duì)含9個(gè)核苷酸的loop環(huán)的siRNA引物，該9個(gè)核苷酸為：TTCAAGAGA；

2)、RNAi表達(dá)載體的構(gòu)建：siRNA引物退火后與雙酶切的RNAi載體連接轉(zhuǎn)化，得到RNAi表達(dá)載體的重組質(zhì)粒。

作為本發(fā)明的豬FLJ小干擾RNA表達(dá)載體的構(gòu)建方法的改進(jìn)，步驟1)為：根據(jù)步FLJ全長(zhǎng)基因序列，篩選并設(shè)計(jì)3對(duì)siRNA引物；該3對(duì)siRNA引物分別為：

引物1：

SENSE：5′-GATCC?CTGTCGCTGGCCGACAGCA?TTCAAGAGA?TGCTGTCGGCCAGCGACAGTT?A-3′

ANTISENSE：5′-AGCTT?AACTGTCGCTGGCCGACAGCA?TCTCTTGAA?TGCTGTCGGCCAGCGACAG?G-3′

引物2：

SENSE：5′-GATCC?GCTGTTCATGCCCCGCAGC?TTCAAGAGA?GCTGCGGGGCATGAACAGCTT??A-3′

ANTISENSE：5′-AGCTT?AAGCTGTTCATGCCCCGCAGC?TCTCTTGAA?GCTGCGGGGCATGAACAGC?G-3′

引物3：

SENSE：5′-GATCC?GGACGTCTACGGCTACTCC?TTCAAGAGA?GGAGTAGCCGTAGACGTCCTT?A-3′

ANTISENSE：5′-AGCTT?AAGGACGTCTACGGCTACTCC?TCTCTTGAA?GGAGTAGCCGTAGACGTCC?G-3′

作為本發(fā)明的豬FLJ小干擾RNA表達(dá)載體的構(gòu)建方法的進(jìn)一步改進(jìn)，步驟2)為：將pSilencer?4.1-CMV?neo質(zhì)粒進(jìn)行BamH?I和Hind?III雙酶切后，與siRNA引物退火后得到的DNA片段連接，采用熱激轉(zhuǎn)化大腸桿菌。

本發(fā)明還同時(shí)提供了對(duì)利用上述方法構(gòu)建所得的豬FLJ有效小干擾RNA表達(dá)載體進(jìn)行鑒定的方法：通過抗生素篩選，將陽(yáng)性克隆采用測(cè)序鑒定；測(cè)序引物為CMV-F：5′-AGGCGATTAAGTTGGGTA-3′。

本發(fā)明還同時(shí)提供了利用上述方法構(gòu)建所得的豬FLJ小干擾RNA表達(dá)載體的用途：用于研究FLJ基因?qū)ωi肌內(nèi)脂肪沉積的影響。

作為本發(fā)明的豬FLJ小干擾RNA表達(dá)載體的用途的改進(jìn)，包括以下步驟：

(1)將含F(xiàn)LJ的siRNA表達(dá)載體的大腸桿菌擴(kuò)培后，提取高純轉(zhuǎn)染級(jí)質(zhì)粒；