[發(fā)明專利]豬FLJ小干擾RNA表達載體的構建、鑒定法及用途

無效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201110440124.8
• 申請日: 2011-12-25
• 公開（公告）號: CN102517328A
• 公開（公告）日: 2012-06-27
• 發(fā)明（設計）人: 汪以真;伍婷;袁章琴
• 申請（專利權）人: 浙江大學
• 主分類號: C12N15/85
• 分類號: C12N15/85;C12N15/66;C12Q1/68
• 代理公司: 杭州中成專利事務所有限公司 33212
• 代理人: 金祺

技術領域

本發(fā)明涉及一種豬FLJ基因小干擾RNA(siRNA)有效表達載體的構建、鑒定及用途，屬于生物和現代農業(yè)技術領域的應用技術。

背景技術

FLJ基因是本課題組通過基因芯片技術篩選獲得的與豬肌內脂肪沉積密切相關的新基因。人類FLJ是2003年測序篩選出來的新基因，功能尚未確定。本本課題組根據豬FLJ基因已知的EST序列，通過RACE技術，克隆得到FLJ全長cDNA序列，FLJ基因全長cDNA序列有2793bp(GenBank登錄號EU030283)，其中包括283bp?5′非編碼區(qū)(5′-untranslated?region，5′-UTRs)、714bp編碼區(qū)(coding?region，CDs)和1796bp的3′非編碼區(qū)(3′-UTR)，編碼區(qū)翻譯237個氨基酸(GenBank登錄號ABS29571)；BLAST結果表明，FLJ氨基酸序列序列與人、鼠同源性分別達到99％，84％。這為后續(xù)研究FLJ基因的功能奠定分子生物學基礎。

RNA干擾(RNAi)技術作為一種新的基因阻斷技術，具有低成本、高效性及高特異性等特點，能特異、高效地抑制特定基因的表達，已經成為研究基因功能的一種有力工具。由于干擾載體pSilencer?4.1-CMV?neo可以方便用于目的基因siRNA表達載體的構建，從而可以特異性的使特定目的基因沉默，功能喪失，因此干擾載體pSilencer?4.1-CMV?neo可以作為一種強有力的研究工具，用于功能基因組的研究。

發(fā)明內容

本發(fā)明要解決的技術問題是提供一種豬FLJ有效小干擾RNA表達載體，以及該小干擾RNA表達載體的用途。

為了解決上述技術問題，本發(fā)明提供一種豬FLJ有效小干擾RNA表達載體的構建方法，包括以下步驟：

1)、根據載體的信息和靶序列設計(并合成)3對含9個核苷酸的loop環(huán)的siRNA引物，該9個核苷酸為：TTCAAGAGA；

2)、RNAi表達載體的構建：siRNA引物退火后與雙酶切的RNAi載體連接轉化，得到RNAi表達載體的重組質粒。

作為本發(fā)明的豬FLJ小干擾RNA表達載體的構建方法的改進，步驟1)為：根據步FLJ全長基因序列，篩選并設計3對siRNA引物；該3對siRNA引物分別為：

引物1：

SENSE：5′-GATCC?CTGTCGCTGGCCGACAGCA?TTCAAGAGA?TGCTGTCGGCCAGCGACAGTT?A-3′

ANTISENSE：5′-AGCTT?AACTGTCGCTGGCCGACAGCA?TCTCTTGAA?TGCTGTCGGCCAGCGACAG?G-3′

引物2：

SENSE：5′-GATCC?GCTGTTCATGCCCCGCAGC?TTCAAGAGA?GCTGCGGGGCATGAACAGCTT??A-3′

ANTISENSE：5′-AGCTT?AAGCTGTTCATGCCCCGCAGC?TCTCTTGAA?GCTGCGGGGCATGAACAGC?G-3′

引物3：

SENSE：5′-GATCC?GGACGTCTACGGCTACTCC?TTCAAGAGA?GGAGTAGCCGTAGACGTCCTT?A-3′

ANTISENSE：5′-AGCTT?AAGGACGTCTACGGCTACTCC?TCTCTTGAA?GGAGTAGCCGTAGACGTCC?G-3′

作為本發(fā)明的豬FLJ小干擾RNA表達載體的構建方法的進一步改進，步驟2)為：將pSilencer?4.1-CMV?neo質粒進行BamH?I和Hind?III雙酶切后，與siRNA引物退火后得到的DNA片段連接，采用熱激轉化大腸桿菌。

本發(fā)明還同時提供了對利用上述方法構建所得的豬FLJ有效小干擾RNA表達載體進行鑒定的方法：通過抗生素篩選，將陽性克隆采用測序鑒定；測序引物為CMV-F：5′-AGGCGATTAAGTTGGGTA-3′。

本發(fā)明還同時提供了利用上述方法構建所得的豬FLJ小干擾RNA表達載體的用途：用于研究FLJ基因對豬肌內脂肪沉積的影響。

作為本發(fā)明的豬FLJ小干擾RNA表達載體的用途的改進，包括以下步驟：

(1)將含FLJ的siRNA表達載體的大腸桿菌擴培后，提取高純轉染級質粒；