[發(fā)明專利]豬FLJ小干擾RNA表達(dá)載體的構(gòu)建、鑒定法及用途

無效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201110440124.8
• 申請日: 2011-12-25
• 公開（公告）號: CN102517328A
• 公開（公告）日: 2012-06-27
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 汪以真;伍婷;袁章琴
• 申請（專利權(quán)）人: 浙江大學(xué)
• 主分類號: C12N15/85
• 分類號: C12N15/85;C12N15/66;C12Q1/68
• 代理公司: 杭州中成專利事務(wù)所有限公司 33212
• 代理人: 金祺

1.豬FLJ有效小干擾RNA表達(dá)載體的構(gòu)建方法，其特征是包括以下步驟：

1)、根據(jù)載體的信息和靶序列設(shè)計(jì)3對含9個(gè)核苷酸的loop環(huán)的siRNA引物，所述9個(gè)核苷酸為：TTCAAGAGA；

2)、RNAi表達(dá)載體的構(gòu)建：siRNA引物退火后與雙酶切的RNAi載體連接轉(zhuǎn)化，得到RNAi表達(dá)載體的重組質(zhì)粒。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的豬FLJ有效小干擾RNA表達(dá)載體的構(gòu)建方法，其特征是所述步驟1)為：

根據(jù)豬FLJ全長序列，篩選并設(shè)計(jì)3對siRNA引物；所述3對siRNA引物分別為：

引物1：

SENSE：5′-GATCCCTGTCGCTGGCCGACAGCATTCAAGAGATGCTGTCGGCCAGCGACAGTTA-3′

ANTISENSE：5′-AGCTTAACTGTCGCTGGCCGACAGCATCTCTTGAATGCTGTCGGCCAGCGACAGG-3′；

引物2：

SENSE：5′-GATCCGCTGTTCATGCCCCGCAGCTTCAAGAGAGCTGCGGGGCATGAACAGCTTA-3′

ANTISENSE：5′-AGCTTAAGCTGTTCATGCCCCGCAGCTCTCTTGAAGCTGCGGGGCATGAACAGCG-3′；

引物3：

SENSE：5′-GATCCGGACGTCTACGGCTACTCCTTCAAGAGAGGAGTAGCCGTAGACGTCCTTA-3′

ANTISENSE：5′-AGCTTAAGGACGTCTACGGCTACTCCTCTCTTGAAGGAGTAGCCGTAGACGTCCG-3′

3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的豬FLJ有效小干擾RNA表達(dá)載體的構(gòu)建方法，其特征是所述步驟2)為：將pSilencer4.1-CMV?neo質(zhì)粒進(jìn)行BamHI和HindIII雙酶切后，與siRNA引物退火后得到的DNA片段連接，采用熱激轉(zhuǎn)化大腸桿菌。

4.對如權(quán)利要求1～3任一方法構(gòu)建所得的豬FLJ有效小干擾RNA表達(dá)載體進(jìn)行鑒定的方法，其特征是：通過抗生素篩選，將陽性克隆采用測序鑒定；測序引物為CMV-F：5′-AGGCGATTAAGTTGGGTA-3′。

5.如權(quán)利要求1～3任一方法構(gòu)建所得的豬FLJ有效小干擾RNA表達(dá)載體的用途，其特征是：用于研究FLJ基因?qū)ωi肌內(nèi)脂肪沉積的影響。

6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的豬FLJ小干擾RNA表達(dá)載體的用途，其特征是包括以下步驟：

1)、將含F(xiàn)LJ的siRNA表達(dá)載體的大腸桿菌擴(kuò)培后，提取高純轉(zhuǎn)染級質(zhì)粒；

2)、將含F(xiàn)LJ的siRNA表達(dá)載體的高純轉(zhuǎn)染級質(zhì)粒轉(zhuǎn)染豬肌內(nèi)脂肪細(xì)胞或其他哺乳動物細(xì)胞，37℃，5％的CO2中保溫4～6h后更換不含抗生素的培養(yǎng)基；

3)、轉(zhuǎn)染48h后，分析siRNA表達(dá)載體對FLJ及脂肪代謝關(guān)鍵功能基因FAS、ACC、ATGL、HSL基因表達(dá)的影響，從而研究FLJ基因的功能。