[發明專利]一種利用三親配對接合并以石油烴為唯一碳源篩選攜帶石油烴降解基因的可自轉移廣宿主質粒的方法

有效

• 申請號: 201110439161.7
• 申請日: 2011-12-23
• 公開（公告）號: CN102517279A
• 公開（公告）日: 2012-06-27
• 發明（設計）人: 李慧;王亞菲;張穎;徐慧;韓斯琴;史榮久;楊偉超;陳冠雄
• 申請（專利權）人: 中國科學院沈陽應用生態研究所
• 主分類號: C12N15/10
• 分類號: C12N15/10
• 代理公司: 沈陽科苑專利商標代理有限公司 21002
• 代理人: 周秀梅;李穎

技術領域

本發明涉及生物學技術和污染土壤生物修復技術交叉領域，具體的說一種利用三親配對接合并以石油烴為唯一碳源篩選攜帶石油烴降解基因的可自轉移廣宿主質粒的方法。

背景技術

石油是一種含有多種烴類(正烷烴、支鏈烷烴、芳香烴、脂環烴)及少量其他有機物(硫化物、氮化物、環烷酸類等)的復雜混合物，是人類最主要的能源之一。但是，隨著石油開采和使用量的增加，大量的石油及其加工品進入環境，其中原油開采和冶煉過程中的工業污水排放和溢油泄漏事故是導致土壤石油烴污染的主要原因，不僅破壞了生態環境，還可通過食物鏈的生物富集作用而直接危害人類健康。特別是多環芳烴(Polycyclic?Aromatic?Hydrocarbon，PAHs)，由于其生物可利用度差、半衰期較長，并且大多具有致畸、致癌和致突變效應，因此成為人類健康的巨大威脅。我國石油工業發展迅速，但也隨之帶來嚴重的環境污染問題，有近千萬畝的耕地受到不同程度的石油烴污染。因此，對石油烴污染土壤進行修復、恢復其生態功能以保障農產品安全是一項十分迫切的任務。

環境中的微生物由于其高度的遺傳多樣性和功能多樣性，在污染物降解過程中發揮著重要作用，從實驗室分離高效功能微生物并投加到環境中加速污染物的代謝是目前主要采用的微生物修復方式。但由于接種的高效降解菌與土著微生物在營養和空間上的競爭及環境中的各種不利條件，往往導致接種的功能微生物很難存活，不能持久發揮生物修復作用。這一問題成為制約生物修復技術高效、持久發揮作用的“瓶頸”。為解決上述“瓶頸”問題，一些學者提出接種攜帶特定降解基因的廣宿主可自我轉移質粒(Self-transmissible?broad?host?range?plasmids)，接種后，隨著廣宿主代謝質粒在環境中的水平基因轉移，代謝基因轉移至土著細菌并在其中表達，可使具有競爭性的土著微生物獲得降解能力，從而不必考慮供體菌的存活條件。這種由廣宿主質粒水平基因轉移介導的生物修復提出了與傳統生物修復技術完全不同的思路和概念，有望成為一種新的污染物生物修復途徑。

所謂的“廣宿主質?！北欢x為至少能夠在變性細菌(Proteobacteria)兩個亞綱(例如β-，γ-)之間互相轉移并穩定傳代的質粒。廣宿主質粒的結構一般由兩個區域組成，一個是質粒骨架(與質粒的復制、穩定性和可轉移性有關)，一個是裝配基因(能夠賦予宿主特定的表型，例如抗藥性、金屬抗性、降解污染物特性等)。這兩個區域一般形成“嵌合”結構(如附圖1所示)，并都具有遺傳多樣性。

目前僅有少數廣宿主質粒進行了全序列分析或者遺傳特性鑒定，在2004年以前進行全序列分析的廣宿主質粒僅有7個。并且研究比較透徹的可自我轉移廣宿主質粒，大都是從可培養的宿主中分離的，提取質粒后進行廣宿主性和遺傳多樣性分析，即所謂的“內源分離法”。但這種方法存在著很大的局限性，首先，大部分細菌是不可培養的，因此這種傳統的從可培養宿主中分離質粒的方法大大降低了發現新的廣宿主質粒的幾率；其次，這種方法不涉及質粒的轉移過程，因此在分離過程中不能確定所分離質粒的自我轉移特性。為了避免這一問題，發展了“外源質粒分離”方法，其中在國外應用較早的是“雙親配對法”。雙親外源質粒分離法的基本原理是，環境樣品本源微生物群落作為廣宿主質粒供體，通過與合適受體菌之間的接合轉移，然后通過質粒所編碼的特定表型特征(例如重金屬抗性或者降解污染物的能力)篩選接合子，從而從環境樣品中獲得廣宿主質粒。但這種方法的局限性在于所分離的質粒必須具有特定的表型特征，才能作為篩選接合子的標記。

發明內容

本發明目的在于提供一種利用三親配對接合并以石油烴為唯一碳源篩選攜帶石油烴降解基因的可自轉移廣宿主質粒的方法的方法。

為實現上述目的，本發明采用的技術方案為：

一種利用三親配對接合并以石油烴為唯一碳源篩選攜帶石油烴降解基因的可自轉移廣宿主質粒的方法，選用不同的Proteobacteria亞綱的染色體帶有選擇標記的受體菌與攜帶不能自我轉移(Tra-Mob+)并帶選擇標記質粒的供體菌，通過與樣品三親配對接合，供體菌的質粒在樣品中的可自轉(Tra+Mob+)廣宿主質粒的協助下進入受體菌，，接合子通過受體菌和供體菌帶有的篩選標記進行篩選，再將篩選的含有可自轉廣宿主質粒的接合子在以石油烴為唯一碳源的培養基中培養，篩選能夠降解石油烴的廣宿主質粒。

所述篩選方法具體為：

1)制備微生物細胞懸液：取待測樣品加入生理鹽水中在搖床上震蕩，而后將懸浮液靜置，取上清液進行離心；沉淀置于LB液體培養基中重懸，充分渦流，待用；