[發明專利]一種利用三親配對接合并以石油烴為唯一碳源篩選攜帶石油烴降解基因的可自轉移廣宿主質粒的方法

有效

• 申請號: 201110439161.7
• 申請日: 2011-12-23
• 公開（公告）號: CN102517279A
• 公開（公告）日: 2012-06-27
• 發明（設計）人: 李慧;王亞菲;張穎;徐慧;韓斯琴;史榮久;楊偉超;陳冠雄
• 申請（專利權）人: 中國科學院沈陽應用生態研究所
• 主分類號: C12N15/10
• 分類號: C12N15/10
• 代理公司: 沈陽科苑專利商標代理有限公司 21002
• 代理人: 周秀梅;李穎

1.一種利用三親配對接合并以石油烴為唯一碳源篩選攜帶石油烴降解基因的可自轉移廣宿主質粒的方法，其特征在于：選用不同的Proteobacteria亞綱的染色體帶有選擇標記的受體菌與攜帶不能自我轉移(Tra-Mob+)并帶選擇標記質粒的供體菌，通過與樣品三親配對接合，供體菌的質粒在樣品中的可自轉(Tra+Mob+)廣宿主質粒的協助下進入受體菌，接合子通過受體菌和供體菌帶有的篩選標記進行篩選，再將篩選的含有可自轉廣宿主質粒的接合子在以石油烴為唯一碳源的培養基中培養，篩選能夠降解石油烴的廣宿主質粒。

2.按權利要求1所述的利用三親配對接合并以石油烴為唯一碳源篩選攜帶石油烴降解基因的可自轉移廣宿主質粒的方法，其特征在于：所述篩選方法具體為：

1)制備微生物細胞懸液：取待測樣品加入生理鹽水中在搖床上震蕩，而后將懸浮液靜置，取上清液進行離心；沉淀置于LB液體培養基中重懸，充分渦流，待用；

2)供體菌和受體菌的活化和液體培養：分別將凍存的攜帶不能自我轉移(Tra-Mob+)并帶選擇標記質粒的供體菌和染色體帶有選擇標記的受體菌在含有相應選擇標記的LB固體培養基30℃下過夜培養；而后上述供體菌、受體菌單菌落分別接種于不含有選擇標記的LB液體培養基中，30℃搖床過夜培養，待用；

3)三親配對：用稀釋10倍的LB培養液將步驟2)中生長充分的供體菌和受體菌培養液分別稀釋至10^-2倍；分別取上述稀釋后供體菌和受體菌與微生物細胞懸液混合，而后離心并用1/10LB液體培養基重懸上述沉淀，重懸后培養液滴至LB固體培養基中30℃下過夜培養，待用；

4)接合子篩選：刮取步驟3)中生長的菌苔，于無菌生理鹽水中重懸培養物，用無菌生理鹽水在無菌條件下稀釋至10^-4，取0.1ml稀釋度為10⁰-10^-1的上述重懸培養物涂布含受體菌的選擇標記和供體菌質粒的選擇標記的雙選擇標記的LB固體培養基中，置于30℃恒溫培養箱中，過夜培養；

5)質粒小量制備和多樣性驗證：挑取步驟4)中接合子單菌落，接入上述含雙選擇標記的LB液體培養基中，30℃搖床過夜培養；而后采用SDS-堿解法提取接合子的質粒，并通過瓊脂糖凝膠電泳，篩選廣宿主質粒；

6)質粒石油烴代謝功能驗證：將上述所得接合子接種于以石油烴為唯一碳源的液體無機鹽培養基中培養，具有石油烴降解能力的接合子在液體培養基中會表現出生長，待培養液中培養基變渾濁，OD600明顯變化，即為該接合子含有以石油烴為唯一碳源的廣宿主石油烴代謝質粒；

或將上述所得接合子點種在以多環芳烴組分為唯一碳源的固體雙層平板上30℃培養，具有石油烴降解能力的接合子在液體培養基中會表現出生長，并將固體平板在紫外光下，菌落周圍培養基在紫外光下的吸收減弱，菌落周圍出現降解暗圈，即該接合子含有以多環芳烴為唯一碳源的廣宿主石油烴代謝質粒。

3.按權利要求2所述的利用三親配對接合并以石油烴為唯一碳源篩選攜帶石油烴降解基因的可自轉移廣宿主質粒的方法，其特征在于：所述LB液體培養基配方為：胰蛋白胨10g，酵母浸粉5g，NaCl?10g，用蒸餾水定容至1000ml，pH?7.2-7.4；LB固體培養基配方為：在LB液體培養基中加入2％重量的瓊脂粉。

4.按權利要求2所述的利用三親配對接合并以石油烴為唯一碳源篩選攜帶石油烴降解基因的可自轉移廣宿主質粒的方法，其特征在于：所述供體菌為E.coli?JM109(pBBR1MCS)(質粒編碼氯霉素抗性)，E.coli?JM109(pBBR1MCS-5)(質粒編碼慶大霉素抗性)或E.coli?DH5(pSU4814)(質粒編碼氯霉素抗性)；受體菌為E.coli?K12rif(利福平抗性)、E.coli?K12nal(萘啶酸抗性)、P.putida?UW3(利福平抗性)或C.necator?JMP228(利福平抗性)。

5.按權利要求2所述的利用三親配對接合并以石油烴為唯一碳源篩選攜帶石油烴降解基因的可自轉移廣宿主質粒的方法，其特征在于：以石油烴為唯一碳源的液體無機鹽培養基：取5g/L石油烴組分母液，0.22μm濾膜除菌，量取50-200μl母液，加入50ml滅菌的液體無機鹽培養基，使底物的終濃度為50-200mg?L^-1。