[發(fā)明專利]一種高純度小鼠骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞的簡(jiǎn)易提取方法

無效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201110438641.1
• 申請(qǐng)日: 2011-12-25
• 公開（公告）號(hào): CN102424813A
• 公開（公告）日: 2012-04-25
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 過常發(fā);王春生;朱鎧;賴顥;徐德民
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 復(fù)旦大學(xué)附屬中山醫(yī)院
• 主分類號(hào): C12N5/074
• 分類號(hào): C12N5/074
• 代理公司: 上海申匯專利代理有限公司 31001
• 代理人: 翁若瑩

技術(shù)領(lǐng)域

?本發(fā)明提供了一種簡(jiǎn)單易行、高純度的小鼠骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞的提取方法，為骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)染、骨骼肌及心肌再生提供種子細(xì)胞。

背景技術(shù)

隨著顯微外科技術(shù)的發(fā)展和人們對(duì)小鼠模型優(yōu)越性的認(rèn)識(shí),?如繁殖快(只需21?天)?、胎仔數(shù)多、維持消耗少及基因、信號(hào)通道與人類相似度高等，小鼠模型在目前的科研中應(yīng)用廣泛。小鼠骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞是骨骼肌中具有分化增殖潛能的肌源性干細(xì)胞。作為成體干細(xì)胞的一種，高純度骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞作為成體種子細(xì)胞及基因治療工程細(xì)胞在缺血性心臟病的治療中展示了良好的臨床應(yīng)用前景。然而，肌衛(wèi)星細(xì)胞在成年骨骼肌中含量較低，約1%-5%，而其數(shù)量在個(gè)體的生命過程中由于各種因素的影響而逐漸減少，且在一般情況下處于細(xì)胞周期的G0期,這就決定了通過原代細(xì)胞分離技術(shù)所能獲取的骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞數(shù)量必然是有限的。因此，其分離和培養(yǎng)技術(shù)一直在不斷地摸索和改進(jìn)中。傳統(tǒng)方法多采用膠原酶和胰酶分步消化及差速貼壁的方式進(jìn)行提取純化，或者通過包有乙烯吡咯烷酮的硅膠顆粒（Percoll）梯度離心法分離衛(wèi)星細(xì)胞，這些方法中，由于對(duì)消化及差速貼壁時(shí)間較難把握，且未形成統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn)，因而得到的衛(wèi)星細(xì)胞依然含有大量的成纖維細(xì)胞等雜質(zhì)細(xì)胞，純度較低；而流式細(xì)胞分選術(shù)、免疫磁珠分選術(shù)和平面黏附分離法等方法可獲得高純度衛(wèi)星細(xì)胞，但部分單位缺乏相應(yīng)的設(shè)備條件，且實(shí)驗(yàn)所需抗體等試劑價(jià)格昂貴，所使用抗體也有相應(yīng)的物種特異性，使這種方法的廣泛應(yīng)用受限。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的是提供一種快速、高效、經(jīng)濟(jì)地獲得高純度的小鼠骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞的方法。

為了達(dá)到上述目的,本發(fā)明提供了一種高純度小鼠骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞的簡(jiǎn)易提取方法,其特征在于,具體步驟為：

第一步：取5～7周齡C57BL/6小鼠，于小鼠四肢肌注射0.75%鹽酸布比卡因0.05～0.15mL；

第二步：36～60小時(shí)后，處死小鼠，用75vol%?酒精浸泡10～20min，在超凈工作臺(tái)內(nèi)剔出四肢肌肉0.5～1.5g，去除血管、脂肪及筋膜，無菌PBS液沖洗，將肌肉剪成0.5～1.5mm³小粒，加入PBS液靜置3～7min，離心,棄上清液；

第三步：加入1～5mL混合消化酶，置于37℃、CO₂體積濃度為5%的孵箱中孵化，每隔10～20min用吸管吹打震蕩3～7min，重復(fù)3次,加入3～7mL含15vol%胎牛血清的F12/DMEM?培養(yǎng)基中止消化，過濾細(xì)胞懸液，將所得濾液離心，棄上清，細(xì)胞沉淀用生長培養(yǎng)基重懸至2～4mL待用；

第四步：以胎牛血清潤濕離心管管壁后，依次將60%Percoll分離液2～4mL、20%Percoll分離液2～4mL、細(xì)胞懸液2～4mL沿管壁注入，離心，用長頭吸管小心吸出20%?Percoll分離液與60%?Percoll分離液分界面的細(xì)胞懸液0.5～1.5mL，離心，得細(xì)胞沉淀；

第五步：細(xì)胞沉淀用生長培養(yǎng)基重懸后移入鼠尾膠包被的培養(yǎng)瓶中，于CO₂溫箱中培養(yǎng)0.5h，命名為PP1，后將培養(yǎng)基連同非貼壁細(xì)胞一同轉(zhuǎn)移到新的培養(yǎng)瓶中再培養(yǎng)0.5h，命名為PP2，之后將培養(yǎng)基連同未貼壁的細(xì)胞轉(zhuǎn)入新的培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)24h，命名為PP3,將PP3繼續(xù)培養(yǎng)72h后全量換液,得到小鼠骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞。

優(yōu)選地，所述的混合消化酶配制方法為：將Ⅱ型膠原酶0.11g，Ⅱ型dispease酶?0.124g，CaCl₂14mg以及PBS50mL混合。

本發(fā)明的原理是：

????骨骼肌中的肌衛(wèi)星細(xì)胞存在于肌纖維的肌膜層與基底膜之間，成體骨骼肌中衛(wèi)星細(xì)胞含量極少，當(dāng)骨骼肌組織受到損傷時(shí)，這些靜息期的肌衛(wèi)星細(xì)胞才會(huì)被激活，大量分裂、增殖、分化。因此，當(dāng)以鹽酸布比卡因預(yù)處理骨骼肌后，能引起肌組織損傷，伴有大量的炎癥細(xì)胞浸潤，從而激活衛(wèi)星細(xì)胞并使其大量增殖。具體機(jī)制可能為，肌組織損傷后產(chǎn)生的大量單核及巨噬細(xì)胞能通過釋放某些具有有絲分裂活性的細(xì)胞因子如IL-6?等和生長因子促進(jìn)肌衛(wèi)星細(xì)胞的活化增殖和分化。此外，有學(xué)者發(fā)現(xiàn)，肌衛(wèi)星細(xì)胞與存活的肌纖維之間的相互接觸之間的接觸會(huì)抑制肌衛(wèi)星細(xì)胞的活化、增殖和分化，布比卡因能選擇性損傷肌纖維而對(duì)肌衛(wèi)星細(xì)胞沒有損傷作用,?肌纖維溶解壞死可導(dǎo)致這種抑制關(guān)系的削弱，引起肌衛(wèi)星細(xì)胞的活化增殖。本實(shí)驗(yàn)中以布比卡因預(yù)處理后，所收獲的細(xì)胞量明顯增高，為純化后保持足量的衛(wèi)星細(xì)胞提供了保障。