[發明專利]一種高純度小鼠骨骼肌衛星細胞的簡易提取方法

無效

• 申請號: 201110438641.1
• 申請日: 2011-12-25
• 公開（公告）號: CN102424813A
• 公開（公告）日: 2012-04-25
• 發明（設計）人: 過常發;王春生;朱鎧;賴顥;徐德民
• 申請（專利權）人: 復旦大學附屬中山醫院
• 主分類號: C12N5/074
• 分類號: C12N5/074
• 代理公司: 上海申匯專利代理有限公司 31001
• 代理人: 翁若瑩

1.一種高純度小鼠骨骼肌衛星細胞的簡易提取方法,其特征在于,具體步驟為：

????第一步：取5～7周齡C57BL/6小鼠，于小鼠四肢肌注射0.75%鹽酸布比卡因0.05～0.15mL；

????第二步：36～60小時后，處死小鼠，用75vol%?酒精浸泡10～20min，在超凈工作臺內剔出四肢肌肉0.5～1.5g，去除血管、脂肪及筋膜，無菌PBS液沖洗，將肌肉剪成0.5～1.5mm³小粒，加入PBS液靜置3～7min，離心,棄上清液；

第三步：加入1～5mL混合消化酶，置于37℃、CO₂體積濃度為5%的孵箱中孵化，每隔10～20min用吸管吹打震蕩3～7min，重復3次,加入3～7mL含15vol%胎牛血清的F12/DMEM?培養基中止消化，過濾細胞懸液，將所得濾液離心，棄上清，細胞沉淀用生長培養基重懸至2～4mL待用；

第四步：以胎牛血清潤濕離心管管壁后，依次將60%Percoll分離液2～4mL、20%Percoll分離液2～4mL、細胞懸液2～4mL沿管壁注入，離心，用長頭吸管小心吸出20%?Percoll分離液與60%?Percoll分離液分界面的細胞懸液0.5～1.5mL，離心，得細胞沉淀；

第五步：細胞沉淀用生長培養基重懸后移入鼠尾膠包被的培養瓶中，于CO₂溫箱中培養0.5h，命名為PP1，后將培養基連同非貼壁細胞一同轉移到新的培養瓶中再培養0.5h，命名為PP2，之后將培養基連同未貼壁的細胞轉入新的培養瓶中培養24h，命名為PP3,將PP3繼續培養72h后全量換液,得到小鼠骨骼肌衛星細胞。

2.如權利要求1所述的高純度小鼠骨骼肌衛星細胞的簡易提取方法,其特征在于,所述的混合消化酶配制方法為：將Ⅱ型膠原酶0.11g，Ⅱ型dispease酶?0.124g，CaCl₂14mg以及PBS50mL混合。