[發明專利]檢測混合物中豹骨成分的方法及所用引物

有效

• 申請號: 201110438052.3
• 申請日: 2011-12-23
• 公開（公告）號: CN102517391A
• 公開（公告）日: 2012-06-27
• 發明（設計）人: 趙興波;彭鵬;姚璐;杜菁;張薇;劉瑩
• 申請（專利權）人: 北京同仁堂股份有限公司;北京同仁堂科技發展股份有限公司;北京中研同仁堂醫藥研發有限公司
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68;C12N15/11
• 代理公司: 北京三友知識產權代理有限公司 11127
• 代理人: 韓蕾

技術領域

本發明涉及應用分子生物學技術檢測混合物特別是藥材中豹骨成分的方法，具體地涉及檢測藥材、或者以豹骨或替代品入藥的中藥制劑中豹骨成分的方法，以及該方法中所用到的特異性引物。

背景技術

豹骨，別名川四腿、金錢豹骨，來源于貓科動物金錢豹Panthera?pardus?L.及其他豹的骨骼。豹骨入藥在我國傳統中醫藥中已有千余年歷史，具有祛風通絡、強筋健骨功效，用于治療風濕痹痛、腰膝酸軟等癥。但目前對于豹骨的鑒別主要采用傳統形態學方法，依賴鑒別人員經驗，主觀性高，因此需要一種能夠準確、有效的鑒別方法。

另一方面，脊椎動物線粒體基因組大小為16kb左右，呈閉合環狀結構，在細胞中呈多拷貝形式存在于線粒體中(依細胞類型不同而異)。動物線粒體基因在進化上保守，且遵循嚴格的母系遺傳特性，因此被廣泛用于起源進化分析和物種鑒定。

在含豹骨成分的混合物例如藥材、或者以豹骨入藥的中藥制劑等的生產加工過程中，豹骨中的部分DNA通常能夠保留于其中，因此，混合物中的豹骨成分可以從其攜帶的DNA檢測中獲得鑒定。

然而，在混合物特別是藥材、中藥制劑中豹骨成分鑒定的研究技術上，由于混合物中豹骨DNA含量很低，并且含有多種抑制PCR反應的成分，因此，如何能夠有效提取其中的DNA是分子生物學技術鑒定豹骨成分的一個關鍵；同時，含豹骨的混合物特別是中藥制劑中通常還具有較多的其它動植物物種，如何設計豹物種特異性引物也成為鑒定技術的另一關鍵。

發明內容

本發明的一個目的在于提供一種利用分子生物學技術檢測混合物特別是藥材、中藥制劑中豹骨成分的方法，以準確、有效地鑒別混合物中是否含有豹骨成分。

本發明的另一目的在于提供一種用于分子生物學技術檢測混合物特別是藥材、中藥制劑中豹骨成分的方法中的特異性引物。

本發明的另一目的在于提供了一種用于分子生物學技術檢測混合物特別是需要鑒別是否為豹骨的藥材、或者以豹骨或替代品入藥的中藥制劑中豹骨成分的試劑盒，其中包含本發明所述的引物。

為達上述目的，一方面，本發明提供了一種利用分子生物學技術檢測混合物中豹骨成分的方法，該方法主要包括：

從待測混合物中提取總DNA；

以所提取的總DNA為模板，利用特異性引物進行聚合酶鏈式反應(Polymerase?Chain?Reaction，PCR)擴增；

對擴增結果進行分析判斷。

如前所述，通常，含豹骨的混合物特別是藥材、或者以豹骨入藥的中藥制劑中，豹骨成分含量很低，并還含有較多的其它動植物物種，還可能含有多種抑制PCR反應的成分，在此情況下，設計豹物種特異性引物是本發明的分子生物學檢測技術的關鍵之一。

根據本發明的具體實施方案，本案發明人從豹骨中提取了總DNA，根據NCBI中公布的金錢豹線粒體DNA與核DNA序列設計引物，經擴增、測序，提交blastn比對、分析等，設計了本發明的豹物種特異性引物。所設計的豹物種特異性引物為選自如下SEQID?Nos.1和2(本發明中亦將該引物對命名為L1F/R)、SEQ?ID?Nos.3和4(本發明中亦將該引物對命名為L2F/R)、以及SEQ?ID?Nos.5和6(本發明中亦將該引物對命名為L3F/R)中的一對、兩對或三對引物：

L1F/R：5’-TTAGGGGTATGTTTAAT-3’(SEQ?ID?NO：1)

???????5’-TTCAGCCATAATTTACA-3’(SEQ?ID?NO：2)

L2F/R：5’-CCGCTTTCTCATCAGTT-3’(SEQ?ID?NO：3)

???????5’-CTCGTCCTACATGCATGTAT-3’(SEQ?ID?NO：4)

L3F/R：5’-GCCGCGATGTAAATTAT-3’(SEQ?ID?NO：5)

???????5’-AGGCTGTGGCCATAACC-3’(SEQ?ID?NO：6)。

如前所述，通常含豹骨的混合物特別是藥材、或者以豹骨入藥的中藥制劑中豹骨DNA成分的含量是很低的，如何能夠有效提取其中的DNA，是本發明檢測豹骨成分技術的另一個關鍵。根據本發明的具體實施方案，本發明的方法中，所述從待測混合物中提取總DNA的過程包括以下步驟：

待測混合物經煮沸法處理20～40分鐘；

加入CTAB提取緩沖液60℃～70℃消化2～4小時；

用酚仿法抽提；