[發明專利]檢測混合物中豹骨成分的方法及所用引物

有效

• 申請號: 201110438052.3
• 申請日: 2011-12-23
• 公開（公告）號: CN102517391A
• 公開（公告）日: 2012-06-27
• 發明（設計）人: 趙興波;彭鵬;姚璐;杜菁;張薇;劉瑩
• 申請（專利權）人: 北京同仁堂股份有限公司;北京同仁堂科技發展股份有限公司;北京中研同仁堂醫藥研發有限公司
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68;C12N15/11
• 代理公司: 北京三友知識產權代理有限公司 11127
• 代理人: 韓蕾

1.一種檢測混合物中豹骨成分的方法，該方法主要包括：

從待測混合物中提取總DNA；

以所提取的總DNA為模板，利用特異性引物進行PCR擴增；所述特異性引物為選自：SEQ?ID?Nos.1和2、SEQ?ID?Nos.3和4、以及SEQ?ID?Nos.5和6中的一對、兩對或三對引物；

對上述擴增結果進行分析判斷。

2.根據權利要求1所述的方法，其中，所述從待測混合物中提取總DNA的過程包括如下步驟：

待測混合物經煮沸法處理20～40分鐘；

加入CTAB提取緩沖液60℃～70℃消化2～4小時；

用酚仿法抽提；

加入異丙醇沉淀富集DNA；

利用PCR純化試劑盒進行純化，得到所提取的總DNA。

3.根據權利要求1或2所述的方法，其中，所述PCR擴增反應條件如下：

反應體系為15μl，其中10×PCR緩沖液1～5.5μl，dNTPs(2.5mM)0.5～1.8μl，上下游引物(10μM)各0.5～1.5μl，Taq?DNA聚合酶(5U/μl)0.2～1.2μl，DNA模板(50ng/μl)0.8～3μl，無菌超純水補至15μl；

擴增條件：95℃預變性5min；95℃變性30s，48～68℃退火30s，72℃延伸30s，35～40個循環；最后72℃延伸7～10min；

優選地，所述SEQ?ID?Nos.1和2的退火溫度為57℃，所述SEQ?ID?Nos.3和4的退火溫度為57℃，所述SEQ?ID?Nos.5和6的退火溫度為57℃。

4.根據權利要求1所述的方法，其中，所述對上述擴增結果進行分析判斷的過程包括用凝膠電泳顯示所述擴增的產物。

5.根據權利要求1所述的方法，其中，所述待測混合物為需要鑒別是否為豹骨的藥材、或者以豹骨或替代品入藥的中藥制劑。

6.根據權利要求1所述的方法，該方法還包括：

將待測混合物樣品的擴增結果與從豹骨中提取DNA進行PCR擴增的結果進行對照，分析判斷所測混合物中是否存在豹骨成分。

7.根據權利要求1或6所述的方法，其中，以SEQ?ID?Nos.1和2、SEQ?ID?Nos.3和4、以及SEQ?ID?Nos.5和6分別進行PCR擴增，擴增出一個、二個或三個相應的目的片段，則所測混合物中存在豹骨成分。

8.用于實現權利要求1～7任一項所述檢測混合物中豹骨成分的方法的引物，該引物包括選自：SEQ?ID?Nos.1和2、SEQ?ID?Nos.3和4、以及SEQ?ID?Nos.5和6中的一對、兩對或三對引物。

9.權利要求8所述的引物在檢測混合物中是否存在豹骨成分中的應用；優選地，所述待測混合物為需要鑒別是否為豹骨的藥材、或者以豹骨或替代品入藥的中藥制劑。

10.一種檢測混合物中豹骨成分的試劑盒，該試劑盒包含權利要求8所述的引物，優選還進一步包括PCR緩沖液、dNTPs和DNA聚合酶。