[發(fā)明專利]一種堿性蛋白酶的生產(chǎn)方法

無效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201110437777.0
• 申請日: 2011-12-23
• 公開（公告）號: CN102517268A
• 公開（公告）日: 2012-06-27
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 路福平;劉逸寒;劉敏堯;劉靚;薄嘉鑫;王春霞;王建玲
• 申請（專利權(quán)）人: 天津科技大學(xué)
• 主分類號: C12N9/54
• 分類號: C12N9/54;C12R1/07
• 代理公司: 天津盛理知識產(chǎn)權(quán)代理有限公司 12209
• 代理人: 王來佳

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于微生物發(fā)酵領(lǐng)域，具體涉及一種堿性蛋白酶的生產(chǎn)方法。

背景技術(shù)

堿性蛋白酶(Alkaline?Protease)屬內(nèi)肽酶中的絲氨酸蛋白水解酶類，可以在堿性條件下水解蛋白質(zhì)肽鍵，其最適作用pH一般為9～11，主要應(yīng)用于加酶洗滌劑工業(yè)，在制革、絲綢、飼料、醫(yī)藥、食品、環(huán)保等工業(yè)也有廣泛的應(yīng)用。

目前，在世界范圍內(nèi)蛋白分解酶是工業(yè)酶中用得最多的酶，約占酶總量的60％，其中堿性蛋白酶就占25％。它在商業(yè)中的巨大應(yīng)用前景及在基礎(chǔ)研究中的重要作用，吸引著國際國內(nèi)的許多公司及研究單位競相對其進(jìn)行多方面的研究。

研究室的前期研究通過低能N⁺離子注入技術(shù)誘變選育得到一株高產(chǎn)堿性蛋白酶的嗜堿芽孢桿菌，并通過正交試驗(yàn)確定其最佳發(fā)酵培養(yǎng)基，其7L規(guī)模發(fā)酵罐酶活力達(dá)到36000U/mL。

清液發(fā)酵指培養(yǎng)基中不含固體不溶物，其發(fā)酵過程中傳質(zhì)效果要優(yōu)于粗料發(fā)酵，且降低后續(xù)分離純化的難度，可以極大降低生產(chǎn)成本。

補(bǔ)料分批發(fā)酵與不補(bǔ)料分批發(fā)酵相比，特點(diǎn)在于使發(fā)酵系統(tǒng)中維持較低的基質(zhì)濃度。低基質(zhì)濃度的優(yōu)點(diǎn)：①可以除去快速利用碳源的阻遏效應(yīng)，并維持適當(dāng)?shù)木w濃度，使不致于加劇供氧矛盾；②避免在培養(yǎng)基中積累有毒代謝物，即代謝阻遏。

本發(fā)明中菌株的發(fā)酵周期55小時左右，產(chǎn)酶高峰期在對數(shù)生長末期，此時營養(yǎng)物質(zhì)濃度較低，不利于產(chǎn)酶。采用高營養(yǎng)物質(zhì)濃度發(fā)酵液發(fā)酵則會產(chǎn)生阻遏效應(yīng)，抑制菌體的生長，同樣不利于產(chǎn)酶。同時發(fā)酵培養(yǎng)基中氮源采用棉籽餅粉，雖利于產(chǎn)酶，但為粗料發(fā)酵，原料利用率低，且含有大量微小顆粒，給后期酶的分離純化帶來困難。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)的不足之處，提供一種堿性蛋白酶的生產(chǎn)方法，本發(fā)明利用堿性蛋白酶高產(chǎn)菌株發(fā)酵生產(chǎn)堿性蛋白酶，采用清液發(fā)酵與補(bǔ)料分批發(fā)酵相結(jié)合的方法，本方法有效提高嗜堿芽孢桿菌產(chǎn)堿性蛋白酶的能力。

本發(fā)明實(shí)現(xiàn)目的的技術(shù)方案如下：

一種堿性蛋白酶的生產(chǎn)方法，生產(chǎn)過程采用補(bǔ)料分批發(fā)酵的方法。

而且，發(fā)酵采用清液發(fā)酵。

而且，發(fā)酵所用微生物為嗜堿芽孢桿菌Bacillus?alcalophilus?Y-22，保藏編號為：CGMCC?No.5313，保藏單位為：中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心。

而且，發(fā)酵步驟如下：

(1)種子的培養(yǎng)：從斜面上挑取一環(huán)新培養(yǎng)的嗜堿性芽孢桿菌Y-22接入種子培養(yǎng)液中(50mL種子培養(yǎng)基/250mL三角瓶)，200r/min，34℃培養(yǎng)12h；

(2)發(fā)酵罐培養(yǎng)：5％v/v接種量轉(zhuǎn)接至液體發(fā)酵培養(yǎng)基；溫度：34℃；轉(zhuǎn)速：250～450r/min；通風(fēng)量：1∶0.5～1∶1.5。發(fā)酵過程中自動流加氨水及20％v/v的鹽酸，使發(fā)酵液pH值維持在7.0；

(3)補(bǔ)料分批發(fā)酵：在堿性蛋白酶高產(chǎn)菌株發(fā)酵產(chǎn)堿性蛋白酶的過程中按一定的比生長速率流加補(bǔ)料培養(yǎng)基，發(fā)酵10-30小時控制比生長速率0.12h^-1，30-55小時控制比生長速率0.6h^-1。

而且，所用發(fā)酵培養(yǎng)基配方為g/L：酵母浸粉17，麥芽糊精100g/L、檸檬酸鈉3g/L、氯化鈣2.6g/L、K₂HPO₄18g/L、pH自然，標(biāo)準(zhǔn)棉籽餅粉水解液150mL/L。

而且，所用補(bǔ)料培養(yǎng)基配方為：麥芽糊精600g/L、檸檬酸鈉3g/L、氯化鈣2.6g/L、K₂HPO₄18g/L、pH自然，標(biāo)準(zhǔn)棉籽餅粉水解液800mL/L。

而且，所述標(biāo)準(zhǔn)棉籽餅粉水解液為棉籽餅粉經(jīng)物理作用及酶水解后得到的上清液。

而且，所述標(biāo)準(zhǔn)棉籽餅粉水解液的制備方法步驟如下：

(1)棉籽餅粉加干重2-5倍的水，高壓蒸煮20-30分鐘，除去對菌體生長有害的棉酚；

(2)加入棉籽餅粉干重1-3％(w/w)復(fù)合酶制劑，45℃，120r/min，攪拌處理120分鐘；

(3)板框過濾，濾液即為棉籽餅粉酶水解液；

(4)將棉籽餅粉酶水解液中蛋白濃度稀釋為25g/L，即為標(biāo)準(zhǔn)棉籽餅粉酶水解液。

而且，所述復(fù)合酶制劑為蛋白酶、纖維素酶、木聚糖酶和果膠酶的混合物。

而且，所述復(fù)配比例為蛋白酶∶纖維素酶∶木聚糖酶∶果膠酶＝3∶1.5∶2.5∶2。

本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)及積極效果是：