[發明專利]一種豬O型口蹄疫合成肽疫苗及其制備方法

無效

• 申請號: 201110437304.0
• 申請日: 2011-12-23
• 公開（公告）號: CN102580076A
• 公開（公告）日: 2012-07-18
• 發明（設計）人: 劉德輝;何俊
• 申請（專利權）人: 廣州自遠生物科技有限公司
• 主分類號: A61K39/135
• 分類號: A61K39/135;C12N15/42;A61P31/14
• 代理公司: 廣州粵高專利商標代理有限公司 44102
• 代理人: 陳衛

技術領域

本發明涉及基因工程領域，具體涉及一種豬O型口蹄疫合成肽疫苗及其制備方法。?

背景技術

口蹄疫（Foot-and-Mouth?Disease，FMD）是由口蹄疫病毒（Foot?and?mouth?virus，FMDV）引起豬、牛、羊等偶蹄獸的一種急性熱性高度接觸性傳染病，嚴重危害家畜的生產力和畜產品質量安全，被OIE列為A類重要傳染病。目前對于該病的防制發達國家主要采取屠殺政策，發展中國家采取隔離和免疫接種政策，其中疾病流行前的免疫接種是特異性保護家畜免遭感染的有效手段。我國目前通過接種滅活疫苗及合成肽疫苗等一些新型疫苗來控制該病的流行。但現有的這些疫苗都存在一些缺陷。如滅活疫苗主要缺點是生物安全性問題及穩定性問題，病毒必須在高度要求的設備中生產，以防散毒；現有的合成肽苗雖然具有良好的保護效果，但生產工藝復雜，成本高不利于降低成本。因而一種廉價、安全、高效的疫苗生產系統的開發具有巨大的應用前景。?

發明內容

本發明的目的在于根據現有合成肽疫苗中存在的生產工藝復雜，成本高的問題，提供一種廉價、安全、高效的豬O型口蹄疫合成肽疫苗。?

本發明另一目的在于提供上述疫苗的制備方法。?

本發明上述目的通過以下技術方案予以實現：?

一種豬O型口蹄疫合成肽疫苗，其氨基酸序列如SEQ?ID?NO:1所示，基因序列如SEQ?ID?NO:2所示；所述氨基酸序列采用的是豬O型口蹄疫VP1蛋白中具有抗原性的141-160位及200-213位氨基酸肽段，并將其組成多拷貝的串聯結構，在肽段連接處加入氨基酸多肽作為接頭；抗原多肽采用如下串聯結構：Y-M-X-N-Y，其中“X”和“Y”分別代表豬O型口蹄疫VP1蛋白141-160、200-213位氨基酸肽段；“M”和“N”分別代表“Pro-Gly”二肽接頭及十一肽接頭，所述十一肽接頭的氨基酸序列如SEQ?ID?NO:3所示。

本發明上述豬O型口蹄疫合成肽疫苗的制備方法包括如下步驟：?

（1）應用重組DNA技術，合成編碼豬O型口蹄疫合成肽的DNA序列，構建pGAPZαA-SP表達載體。

（2）重組表達載體pGAPZαA-SP轉化宿主細胞畢赤酵母中，構建表達工程菌：將感受態P.pastoris?X33(80μL)與Bln線性化的pGAPZαA-SP?(10?μg)相混合，1.5?kV、200電擊5?ms。將轉化后的酵母細胞鋪于新鮮制備的YPDS平板（含100?μg/ml?Zeocin）上，將平板倒置，于30℃溫箱中培養至單菌落出現（需要3-5?d）。采用煮—凍—煮法制備PCR?模板分析P.pastoris?轉化子，以引物能擴增出約200bp的克隆子定為陽性轉化子。再經不同濃度Zeocin?的YPD平板篩選高拷貝克隆，以用于高效表達目的蛋白。?

（3）發酵培養重組酵母菌，進行表達，表達產物作SDS-PAGE及Western-blot分析鑒定；?

（4）表達產物純化，并選用佐劑乳化制成新型的豬O型口蹄疫合成肽疫苗。

作為一種優選方案，上述方法中，所述表達載體為畢赤酵母表達載體。?

作為一種優選方案，上述方法中，所述步驟（3）具體為用滅菌牙簽細挑篩選到的具有Zeocin?抗性的單菌落，挑于5?mL?的YPD?液體培養基中進行一級培養，28℃-30℃，200?r/min?振蕩過夜，至OD600=2-6，此時細胞處于對數生長期；取1?mL一級培養液，重懸于30?mL?的YPD?中，繼續振蕩培養，用四層干凈的紗布外加兩層報紙包扎。培養72小時，3000?r/min?離心5?min，收集培養液上清，即得純化蛋白。?

作為一種優選方案，上述方法中，所述步驟（4）中所述佐劑為進口油乳佐劑。

與現有技術相比，本發明具有如下有益效果：?

畢赤酵母菌作為外源基因真核表達系統，具有較高的表達量。用畢赤酵母基因表達系統生產蛋白質具有很大的發展前景，國外已有多種蛋白酶及抗體基因得到了高效表達,一些已經商品化生產。酵母具有比大腸桿菌更完備的基因表達調控機制和對表達產物的加工修飾及分泌能力，且不會產生內毒素，是基因工程中良好的真核基因受體菌。本發明選用野生型畢赤酵母菌X33，生長速度快，而且自身分泌內源性蛋白很少，這就大大減少了我們對培養基中的外源基因表達產物的純化，有助于提高表達量。?pGAPZαA?為一種非誘導分泌型表達載體,?不需甲醇誘導，所表達異源蛋白直接分泌到培養基中，便于目的基因表達產物的純化，且培養基價格低廉，更利于實現工業化生產。