[發明專利]一種雙固定化多酶體系生產L-2-氨基丁酸的方法

有效

• 申請號: 201110436859.3
• 申請日: 2011-12-23
• 公開（公告）號: CN102517351A
• 公開（公告）日: 2012-06-27
• 發明（設計）人: 李鑫
• 申請（專利權）人: 李鑫
• 主分類號: C12P13/04
• 分類號: C12P13/04;C12N11/18
• 代理公司: 江蘇圣典律師事務所 32237
• 代理人: 胡建華

技術領域??

??本發明屬于生物技術領域，具體涉及一種以L-蘇氨酸為原料，以共固定化的L-蘇氨酸脫氨酶和亮氨酸脫氫酶為生物轉化催化劑，以共固定化醇氧化酶、甲醛脫氫酶和甲酸脫氫酶為輔酶再生催化劑，生產L-2-氨基丁酸及回收固定化酶的方法。

背景技術??

L-2-氨基丁酸是一種人體神經信息傳遞的天然氨基酸，也是一種重要的化工原料和醫藥中間體，廣泛應用于藥物合成，例如：抗癲癇藥物左乙拉西坦、抗結核藥物鹽酸乙胺丁醇等。目前，L-2-氨基丁酸主要應用于合成左乙拉西坦藥物，左乙拉西坦是一種新型抗癲癇藥物，2000年FDA認證，在歐美地區上市銷售，是目前美國癲癇治療中應用最多的新型抗癲癇藥物，2007年左乙拉西坦在中國正式上市銷售。而L-2-氨基丁酸是左乙拉西坦的主要手性前體化合物。

目前，L-2-氨基丁酸的制備方法主要分為化學法和酶催化方法。化學法主要包括脫硫反應法、氨化水解反應法、丁酮酸還原法、鹵代酸氨解法等等（尹先清等.?α-氨基丁酸化學合成研究進展.?精細化工中間體,?2010,?40(1):?12-14）。化學法合成L-2-氨基丁酸，雖然操作簡便，但由于L-2-氨基丁酸是手性氨基酸，化學合成過程中，反應條件苛刻，副產物多，易形成消旋產物，造成生產成本高、立體選擇性差、化學污染大、反應產物成分復雜、分離純化困難等缺點。酶催化方法則避免了化學合成方法中存在的缺點，具有立體選擇性高、反應條件溫和、生產成本低、污染少等優點。目前，酶催化方法制備L-2-氨基丁酸，主要采用兩種方法：一是轉氨酶法，祝俊等人以L-蘇氨酸為底物，采用蘇氨酸脫氨酶和亮氨酸脫氫酶生物轉化制備L-2-氨基丁酸，引入甲酸脫氫酶解決輔酶再生問題（CN?101818178）。楊晟等人也以L-蘇氨酸為底物，采用蘇氨酸脫氨酶轉氨后制備丁酮酸，再采用多種L-氨基酸脫氫酶轉化制備L-2-氨基丁酸，NADH再生除了采用甲酸脫氫酶再生系統外，還采用葡萄糖脫氫酶和亞磷酸脫氫酶輔酶再生系統（CN?102212567）。Shin等人以2-丁酮酸為底物，以源于河流弧菌的ω-轉氨酶生物轉化制備L-2-氨基丁酸（Jong-Shik?Shin?and?Byung-Gee?Kim.?Transaminase-catalyzed?asymmetric?synthesis?of?L-2-aminobutyric?acid?from?achiral?reactants.?Biotechnology?Letters,?2009,?31:?1595-1599.）；二是酶拆分法，以化學合成的消旋DL型氨基酸為底物，采用L-氨基酸酰化酶生物轉化制備L-2-氨基丁酸，L-氨基酸的理論最高只有50%（Enzyme?and?Microbial?Technology,?1999,?24(7):?381-387）。奚強等人以豬腎氨基酰化酶為生物催化劑水解N-乙酰氨基丁酸，制備L-2-氨基丁酸，收率可達71.8%（武漢工程大學學報,?2009,?31(3):?26-29）。

????酶催化法制備L-2-氨基丁酸雖然具備化學合成法無可比擬的優勢，但目前這些酶催化法無一例外地采用蘇氨酸脫氨酶、亮氨酸脫氫酶和甲酸脫氫酶三種游離酶生物轉化制備L-2-氨基丁酸。這類方法存在著三種游離酶一次使用、無法回收再利用，酶活力穩定性差、易失活，輔酶再生效率低，游離酶與產物混合在一起、增加分離純化負擔等缺點。與游離酶相比，固定化酶的優勢在于既保持高效、專一、溫和的酶催化反應特性的同時，又具有高穩定性、分離回收容易、多次重復使用、操作的連續可控性以及工藝簡便等優點。

發明內容???

本發明所要解決的技術問題是提供一種雙固定化多酶體系生產L-2-氨基丁酸的方法。該方法利用一種可逆溶解pH敏感高分子載體固定化蘇氨酸脫氨酶與亮氨酸脫氫酶的共固定化多酶體系和一種可逆溶解pH敏感高分子載體固定化醇氧化酶、甲醛脫氫酶和甲酸脫氫酶的共固定化輔酶再生體系，以提高固定化酶穩定性、輔酶再生效率、與反應底物之間的可及性以及提高固定化酶的回收再利用率。

為解決上述技術問題，本發明所采用的技術方案如下：

一種雙固定化多酶體系生產L-2-氨基丁酸的方法，該方法包括如下步驟：

(1)?蘇氨酸脫氨酶和亮氨酸脫氫酶的共固定化多酶體系的制備：

(1a)?可逆溶解性pH敏感高分子載體溶液與含有蘇氨酸脫氨酶和亮氨酸脫氫酶的酶液充分混合，在25℃、pH?8.0的條件下，溫育0.2~6小時，優選0.5~3小時；