[發明專利]一種雙固定化多酶體系生產L-2-氨基丁酸的方法

有效

• 申請號: 201110436859.3
• 申請日: 2011-12-23
• 公開（公告）號: CN102517351A
• 公開（公告）日: 2012-06-27
• 發明（設計）人: 李鑫
• 申請（專利權）人: 李鑫
• 主分類號: C12P13/04
• 分類號: C12P13/04;C12N11/18
• 代理公司: 江蘇圣典律師事務所 32237
• 代理人: 胡建華

1.一種雙固定化多酶體系生產L-2-氨基丁酸的方法，其特征在于，該方法包括如下步驟：

(1)?蘇氨酸脫氨酶和亮氨酸脫氫酶的共固定化多酶體系的制備：

(1a)?可逆溶解性pH敏感高分子載體溶液與含有蘇氨酸脫氨酶和亮氨酸脫氫酶的酶液充分混合，在25℃、pH?8.0的條件下，溫育0.2~6小時；

(1b)?溫育結束后，用0.1mol/L的磷酸溶液調節溶液pH低于6.0，靜置2~4小時，得懸浮液，離心后得到固體微球，用0.05mol/L、pH6.0的磷酸鹽緩沖液洗滌微球，洗滌懸浮液離心后得到固體微球，重復洗滌離心過程2~3次，得到共固定化多酶體系，置于4℃保存備用；

(2)?醇氧化酶、甲醛脫氫酶和甲酸脫氫酶的共固定化輔酶再生體系的制備：

(2a)?可逆溶解性pH敏感高分子載體溶液與含有醇氧化酶、甲醛脫氫酶和甲酸脫氫酶的酶液充分混合，在25℃、pH?8.0的條件下，溫育0.2~6小時；

(2b)?溫育結束后，用0.1mol/L的磷酸溶液調節溶液pH低于6.0，靜置2~4小時，得懸浮液，離心后得到固體微球，用0.05mol/L、pH6.0的磷酸鹽緩沖液洗滌微球，洗滌懸浮液離心后得到固體微球，重復洗滌離心過程2~3次，得到共固定化輔酶再生體系，置于4℃保存備用；

(3)?利用共固定化多酶體系和共固定化輔酶再生體系生產L-2-氨基丁酸：

(3a)?將L-蘇氨酸和甲醇溶解于0.05mol/L磷酸鹽緩沖液中，用氨水調節pH值到7.0~8.0之間，L-蘇氨酸的加入量為30~200g/L，甲醇的加入量為7~50g/L；

(3b)?向步驟(3a)得到的體系中加入步驟(1b)得到的共固定化多酶體系和步驟(2b)得到的共固定化輔酶再生體系，再加入氧化型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸，氧化型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸的加入量為0.02~0.2g/L，在20~40℃下反應6~48小時；

(3c)?步驟(3b)反應結束后，用0.1mol/L的磷酸溶液調節體系的pH低于6.0，靜置2~4小時，得懸浮液，離心后得到固體微球和上清液；

(3d)?步驟(3c)得到的固體微球，用0.05mol/L、pH6.0的磷酸鹽緩沖液洗滌微球，洗滌懸浮液離心后得到固體微球，重復洗滌離心過程2~3次，最后加入0.05mol/L、pH8.0的磷酸鹽緩沖液溶解固體微球，以備下次使用；

(3e)?步驟(3c)得到的上清液，經濃縮結晶，烘干得到L-2-氨基丁酸。

2.根據權利要求1所述的雙固定化多酶體系生產L-2-氨基丁酸的方法，其特征在于，步驟(1a)和(2a)中，所述的可逆溶解性pH敏感高分子載體為Eudragit?S-100。

3.根據權利要求1所述的雙固定化多酶體系生產L-2-氨基丁酸的方法，其特征在于，步驟(1a)中，所述的可逆溶解性pH敏感高分子載體溶液中，可逆溶解性pH敏感高分子載體濃度為20g/L，溶劑為0.05mol/L、pH?8.0磷酸鹽緩沖液；所述的含有蘇氨酸脫氨酶和亮氨酸脫氫酶的酶液中，蘇氨酸脫氨酶的濃度為20～200IU/L，亮氨酸脫氫酶的濃度為50～150IU/L，以0.05mol/L、pH?8.0的磷酸鹽緩沖液為溶劑配制酶液；可逆溶解性pH敏感高分子載體溶液與含有蘇氨酸脫氨酶和亮氨酸脫氫酶的酶液體積比為1:1~10。

4.根據權利要求1所述的雙固定化多酶體系生產L-2-氨基丁酸的方法，其特征在于，步驟(2a)中，所述的可逆溶解性pH敏感高分子載體溶液中，可逆溶解性pH敏感高分子載體濃度為20g/L，溶劑為0.05mol/L、pH?8.0磷酸鹽緩沖液；所述的含有醇氧化酶、甲醛脫氫酶和甲酸脫氫酶的酶液中，醇氧化酶的濃度為50~150IU/L，甲醛脫氫酶的濃度為50~150IU/L，甲酸脫氫酶的濃度為50~150IU/L，以0.05mol/L、pH?8.0的磷酸鹽緩沖液為溶劑配制酶液；可逆溶解性pH敏感高分子載體溶液與含有醇氧化酶、甲醛脫氫酶和甲酸脫氫酶的酶液體積比為1:1~10。

5.?根據權利要求1所述的雙固定化多酶體系生產L-2-氨基丁酸的方法，其特征在于，步驟(3b)中，共固定化多酶體系加入量控制蘇氨酸脫氨酶濃度為5000～15000IU/L，亮氨酸脫氫酶濃度為8000～15000IU/L；共固定化輔酶再生體系加入量控制醇氧化酶濃度為4000～15000IU/L，甲醛脫氫酶濃度為4000～15000IU/L，甲酸脫氫酶濃度為4000～15000IU/L。