[發(fā)明專(zhuān)利]產(chǎn)蛋白酶的菌株、制備蛋白酶液的方法及使用該酶液于改善低次等煙葉品質(zhì)

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201110435521.6
• 申請(qǐng)日: 2011-12-22
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN102816710A
• 公開(kāi)（公告）日: 2012-12-12
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 王毅;魏云林;馬永凱;唐興宏;季秀玲;于會(huì)喜;吳瀟
• 申請(qǐng)（專(zhuān)利權(quán)）人: 紅塔煙草（集團(tuán)）有限責(zé)任公司
• 主分類(lèi)號(hào): C12N1/20
• 分類(lèi)號(hào): C12N1/20;C12N9/54;A24B15/20;C12R1/07
• 代理公司: 昆明今威專(zhuān)利商標(biāo)代理有限公司 53115
• 代理人: 賽曉剛

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及一株產(chǎn)蛋白酶的細(xì)菌菌株、制備蛋白酶液方法及使用其蛋白酶液改善低次等煙葉品質(zhì)，具體地說(shuō)是利用來(lái)自煙葉上的優(yōu)勢(shì)菌株發(fā)酵蛋白酶液改善低次等煙葉品質(zhì)的方法。?

背景技術(shù)

我國(guó)是烤煙生產(chǎn)和消費(fèi)大國(guó)，烤煙生產(chǎn)在煙草的發(fā)展中占據(jù)重要地位。目前我國(guó)煙葉質(zhì)量與生產(chǎn)水平同國(guó)際先進(jìn)水平相比，仍然有較大差距，還遠(yuǎn)不能滿(mǎn)足提高國(guó)內(nèi)卷煙質(zhì)量和擴(kuò)大出口的需要。提高煙葉品質(zhì)和可用性直接關(guān)系到我國(guó)煙草行業(yè)持續(xù)、穩(wěn)定、健康發(fā)展，也是增強(qiáng)我國(guó)煙葉國(guó)際市場(chǎng)競(jìng)爭(zhēng)力的必由之路。?

由于煙的品種、種植和烘烤等原因，我國(guó)烤煙蛋白質(zhì)、淀粉等大分子物質(zhì)含量往往偏高。蛋白質(zhì)含量與煙葉品質(zhì)優(yōu)劣存在緊密相關(guān)性，蛋白質(zhì)含量過(guò)高，不僅會(huì)降低煙制品的燃燒性，而且有似燒焦羽毛的臭味，同時(shí)伴有辛辣、苦澀的感覺(jué)。此外會(huì)使煙氣中有害成分如HCN等含量增加，嚴(yán)重影響煙葉的香味品質(zhì)和吸食安全性。另一方面煙葉蛋白質(zhì)水解產(chǎn)物可以進(jìn)一步轉(zhuǎn)化生成有利于煙葉品質(zhì)的致香物質(zhì)。因此，降低煙葉中蛋白質(zhì)含量對(duì)改善煙葉品質(zhì)、提高煙葉可用性和吸食安全性極為重要。?

在蛋白酶催化作用下煙葉上的蛋白質(zhì)可以被水解為氨基酸等小分子物質(zhì)，不但降解了蛋白質(zhì)，且水解產(chǎn)物和進(jìn)一步轉(zhuǎn)化的產(chǎn)物又可以產(chǎn)生煙草致香物質(zhì)。蛋白酶來(lái)源即可購(gòu)買(mǎi)商品酶也利用微生物發(fā)酵制備，但商品酶價(jià)格較高，這無(wú)形中增加了卷煙成本，而利用細(xì)菌發(fā)酵蛋白酶液操作方便且工藝簡(jiǎn)單。?

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的是提供一株產(chǎn)蛋白酶的細(xì)菌菌株及利用細(xì)菌發(fā)酵蛋白酶液，使用經(jīng)過(guò)濾除菌及超濾濃縮液作為改善低次等煙葉品質(zhì)的方法。?

本發(fā)明的技術(shù)方案如下：一株短小芽孢桿菌（Bacillus?pumilus）0855-9菌株，菌株保藏號(hào)是（CGMCC?No.?5310），保藏單位:?中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心,?保藏單位地址:北京市朝陽(yáng)區(qū)北辰西路1號(hào)院3號(hào)，保藏日期:??2011年9月29日,該菌株分離自醇化煙葉，產(chǎn)蛋白酶能力較強(qiáng)。?

該0855-9菌株篩選培養(yǎng)基采用酪蛋白瓊脂培養(yǎng)基：酪蛋白10g，牛肉膏3g，Na₂HP0₄2g，NaCl?5g，瓊脂15g，蒸餾水1000mL，0.4％溴麝香草酚藍(lán)溶液12.5mL，pH7.4，觀察水解圈產(chǎn)生情況，復(fù)篩采用福林-酚法測(cè)定蛋白酶的酶活。?

細(xì)菌發(fā)酵制備蛋白酶液具體步驟為：?

①芽孢桿菌的活化和培養(yǎng)：該芽孢桿菌的菌株保藏號(hào)是(CGMCC?No.5310)，經(jīng)LB培養(yǎng)基活化后接入滅菌的種子培養(yǎng)基，于37℃、150rpm恒溫?fù)u床培養(yǎng)12h，按1∶100的比例?轉(zhuǎn)接于1L搖瓶中發(fā)酵60h制得發(fā)酵蛋白酶液；?

②發(fā)酵蛋白酶液的加工：發(fā)酵好的蛋白酶液經(jīng)0.22μm中空纖維管過(guò)濾除菌，再經(jīng)10000MWCO超濾濃縮制得粗酶液；?

以上所述的種子培養(yǎng)基及發(fā)酵培養(yǎng)基均是LB培養(yǎng)基，其主要組分為：NaCl?10g，酵母粉5g，胰蛋白胨10g，加蒸餾水至1000ml，用NaOH溶液調(diào)節(jié)pH值至7.0，121℃高壓滅菌20min。?

酶活性測(cè)定：細(xì)菌發(fā)酵蛋白酶液采用福林-酚法測(cè)定酶活性，其活力單位定義(U)：在37℃每分鐘水解酪蛋白產(chǎn)生1μg酪氨酸，定義為1個(gè)酶活力單位。?

使用制備的蛋白酶液作為改善低次等煙葉步驟是：?

將上部煙葉回潮后抽去煙梗，切絲，稱(chēng)取一定量的煙絲，分為兩份；其中一份煙絲在室溫下(24℃左右)按2％的比例均勻地噴施值得的粗酶液和蒸餾水，置于自封袋中在室溫下使酶作用12h；然后于90℃條件下烘干30mins使酶失活，置于22℃、相對(duì)濕度55％的恒溫恒濕箱平衡煙絲水分24h；以此煙絲為單一原料卷煙后進(jìn)行評(píng)吸鑒定，另一份煙絲作為該組比對(duì)參照物使用。?

本發(fā)明菌株發(fā)酵的蛋白酶液可以改善煙葉香氣質(zhì)，雜氣減輕，質(zhì)感、口感較好，煙葉品質(zhì)明顯改善。煙草科技工作者研究表明煙葉上微生物所產(chǎn)酶能促進(jìn)煙葉上大分子物質(zhì)的轉(zhuǎn)化，有利于提高煙葉品質(zhì)，所以利用分離自煙葉的產(chǎn)酶菌株發(fā)酵蛋白酶液改善低次等煙葉品質(zhì)有重要的研究?jī)r(jià)值，為利用細(xì)菌發(fā)酵酶液改善煙葉品質(zhì)、提高煙葉可用性提供了一種途徑。?

附圖說(shuō)明

圖1：蛋白酶酶活測(cè)定標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)。?

具體實(shí)施方式

本發(fā)明的發(fā)酵蛋白酶液來(lái)源：產(chǎn)酶菌株是短小芽孢桿菌(Bacillus?pumilus)0855-9菌株，菌株保藏號(hào)是(CGMCC?No.5310)。該菌株分離自醇化煙葉，產(chǎn)蛋白酶能力較強(qiáng)，能有效地改善煙葉品質(zhì)。?