[發明專利]產蛋白酶的菌株、制備蛋白酶液的方法及使用該酶液于改善低次等煙葉品質

有效

• 申請號: 201110435521.6
• 申請日: 2011-12-22
• 公開（公告）號: CN102816710A
• 公開（公告）日: 2012-12-12
• 發明（設計）人: 王毅;魏云林;馬永凱;唐興宏;季秀玲;于會喜;吳瀟
• 申請（專利權）人: 紅塔煙草（集團）有限責任公司
• 主分類號: C12N1/20
• 分類號: C12N1/20;C12N9/54;A24B15/20;C12R1/07
• 代理公司: 昆明今威專利商標代理有限公司 53115
• 代理人: 賽曉剛

1.一株短小芽孢桿菌(Bacillus?pumilus)0855-9菌株，菌株保藏號是(CGMCC?No.5310)，該菌株分離自醇化煙葉，產蛋白酶能力較強。

2.根據權利要求1所述的短小芽孢桿菌(Bacillus?pumilus)，其特征在于該0855-9菌株篩選培養基采用酪蛋白瓊脂培養基：酪蛋白10g，牛肉膏3g，Na₂HPO₄?2g，NaCl?5g，瓊脂15g，蒸餾水1000mL，0.4％溴麝香草酚藍溶液12.5mL，pH7.4，觀察水解圈產生情況，復篩采用福林-酚法測定蛋白酶的酶活。

3.使用權利要求1所述的短小芽孢桿菌(Bacillus?pumilus)0855-9菌株制備蛋白酶液的方法，其特征在于細菌發酵制備蛋白酶液具體步驟為：

①芽孢桿菌的活化和培養：該芽孢桿菌的菌株保藏號是(CGMCC?No.5310)，經LB培養基活化后接入滅菌的種子培養基，于37℃、150rpm恒溫搖床培養12h，按1∶100的比例轉接于1L搖瓶中發酵60h制得發酵蛋白酶液；

②發酵蛋白酶液的加工：發酵好的蛋白酶液經0.22μm中空纖維管過濾除菌，再經10000MWCO超濾濃縮制得粗酶液；

以上所述的種子培養基及發酵培養基均是LB培養基，其主要組分為：NaCl?10g，酵母粉5g，胰蛋白胨10g，加蒸餾水至1000ml，用NaOH溶液調節pH值至7.0，121℃高壓滅菌20min。

4.根據權利要求3所述的短小芽孢桿菌(Bacillus?pumilus)0855-9菌株制備蛋白酶液，其特征在于酶活性測定：細菌發酵蛋白酶液采用福林-酚法測定酶活性，其活力單位定義(U)：在37℃每分鐘水解酪蛋白產生1μg酪氨酸，定義為1個酶活力單位。

5.根據權利要求3所述的短小芽孢桿菌(Bacillus?pumilus)0855-9菌株制備蛋白酶液，其特征在于使用制備的蛋白酶液作為改善低次等煙葉步驟是：

將上部煙葉回潮后抽去煙梗，切絲，稱取一定量的煙絲，分為兩份；其中一份煙絲在室溫下(24℃左右)按2％的比例均勻地噴施值得的粗酶液和蒸餾水，置于自封袋中在室溫下使酶作用12h；然后于90℃條件下烘干30mins使酶失活，置于22℃、相對濕度55％的恒溫恒濕箱平衡煙絲水分24h；以此煙絲為單一原料卷煙后進行評吸鑒定，另一份煙絲作為該組比對參照物使用。