[發(fā)明專利]一種采用共固定化雙酶水解魚鱗膠原蛋白制備抗氧化活性肽的方法

有效

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• 申請日: 2011-12-23
• 公開（公告）號: CN102533913A
• 公開（公告）日: 2012-07-04
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 楊安樹;陳紅兵;吳志華;李欣
• 申請（專利權(quán)）人: 南昌大學
• 主分類號: C12P21/06
• 分類號: C12P21/06;C12N11/10;C07K1/34
• 代理公司: 南昌新天下專利商標代理有限公司 36115
• 代理人: 施秀瑾

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于食品生物技術(shù)領(lǐng)域，涉及制備生物活性肽的方法。

背景技術(shù)

我國魚類資源十分豐富，淡水魚養(yǎng)殖量居世界第一位。目前，淡水魚加工主要局限在魚體肌肉加工方面，如魚糜，魚丸等。受傳統(tǒng)觀念和加工技術(shù)的制約，在魚肉加工過程中產(chǎn)生的大量下腳料如魚鱗、內(nèi)臟等很少被利用，而是當作垃圾扔棄。據(jù)估計，我國每年廢棄的魚鱗達30萬噸，不僅浪費了資源，還污染了環(huán)境。

魚鱗含有豐富的蛋白質(zhì)，占魚鱗總質(zhì)量的50%-70%，主要是膠原蛋白，其次為角蛋白和其它的粘蛋白等。研究發(fā)現(xiàn)魚鱗中膠原蛋白含有豐富的甘氨酸、脯氨酸及羥脯氨酸，具有低過敏性、分子結(jié)構(gòu)較脆弱、酶解較容易等特點，其水解產(chǎn)物中含有生物活性肽。而膠原蛋白肽具有分子量低、易吸收、低黏度等特性，同時具有免疫調(diào)節(jié)、抗血栓、降血壓、降膽固醇以及抗氧化等生理功能。因此，膠原蛋白肽已被廣泛應(yīng)用于醫(yī)藥、食品、日用化工等領(lǐng)域。

目前，由膠原蛋白制備生物活性肽的方法有化學法和酶解法，由于酶解法具有作用溫和、高效、易控、安全等優(yōu)勢，在蛋白質(zhì)深加工和活性成分提取領(lǐng)域被廣泛應(yīng)用。特別是利用酶固定化技術(shù)可增大酶對溫度和pH的適應(yīng)范圍，提高了酶的使用效率，且在反應(yīng)結(jié)束后，很容易將酶與反應(yīng)液分開，簡化了產(chǎn)物的分離純化。近年來，隨著酶工程技術(shù)的發(fā)展，在單酶固定化技術(shù)的基礎(chǔ)上又建立了多酶共固定化技術(shù)，多酶共固定化體系擁有固定化酶的高穩(wěn)定性和連續(xù)操作能力，又具有多酶的協(xié)同作用，該技術(shù)已展現(xiàn)了十分廣闊的應(yīng)用前景。根據(jù)查閱已有文獻，國內(nèi)尚未有關(guān)利用多酶共固定化技術(shù)加工水產(chǎn)品的相關(guān)報道。本發(fā)明以草魚魚鱗為原料，將其進行浸酸脫鈣、浸堿脫雜蛋白處理，然后經(jīng)共固定化雙酶酶解，再通過超濾和真空濃縮等分離純化，最后經(jīng)冷凍干燥得到抗氧化活性多肽。本發(fā)明對于提高淡水魚加工的附加值，實現(xiàn)魚鱗廢棄物的綜合利用具有重要意義。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的主要目的在于提供一種共固定化雙酶酶解魚鱗中膠原蛋白制備抗氧化活性肽方法。

本發(fā)明為解決其技術(shù)問題所采取的技術(shù)方案如下。

（1）交聯(lián)法共固定化雙酶。

以木瓜蛋白酶、胰蛋白酶、中性蛋白酶、Flavourzyme風味蛋白酶、Alcalase堿性蛋白酶中任意兩種酶組成復(fù)合蛋白酶，按照活力比為1:1-1:3將兩種酶溶于磷酸鹽緩沖液中配制成質(zhì)量濃度為1.0-5.0%蛋白酶溶液，取配制的蛋白酶溶液加入pH4-10、質(zhì)量濃度為2.0-6.0%的海藻酸鈉溶液中，蛋白酶溶液與海藻酸鈉溶液體積比為1:1-1:5。待充分攪拌均勻后，加入質(zhì)量濃度為0.5-5.0%的氯化鈣（CaCl₂）溶液中，移入4℃冰箱硬化2-6?h，過濾洗滌。然后加入體積分數(shù)為0.1-3%戊二醛溶液中，振蕩0.5?h，于4-25℃靜置交聯(lián)4-6?h，用磷酸鹽緩沖液將殘余戊二醛和未固定化的酶洗去，用冷風吹干表面水分得共固定化雙酶。

共固定化酶活力的測定。

在具塞試管中加入固定化酶0.3?g，3?mL酶激活劑?(0.1mol/?L，pH7.2的磷酸緩沖液中含20?mmol/L半胱氨酸和1?mmol/?LEDTA，現(xiàn)配)，37℃水浴中預(yù)熱10?min，加入酪蛋白溶液10?mL，攪勻后在37℃水浴中精確反應(yīng)10?min，然后加入10?mL三氯醋酸溶液，劇烈搖動后，37℃水浴放置30?min，在275?nm處測定吸光度。

（2）魚鱗預(yù)處理。

將新鮮魚鱗浸泡洗凈其表面粘附物，烘干，然后粉碎并過篩網(wǎng)。稱取魚鱗粉放入酸溶液中勻速攪拌脫鈣，然后用堿浸泡處理，脫除附著在魚鱗表面的魚銀、色素物質(zhì)和可溶性雜蛋白。

（3）共固定化酶定向水解魚鱗蛋白。

控制溫度為40-60℃，pH在6-10，按魚鱗質(zhì)量比1-5%加入固定化雙酶酶解，酶解時間為2-6?h，期間不斷攪拌并加入酸液或堿液使反應(yīng)體系維持在初始值pH值，酶水解反應(yīng)結(jié)束后升溫至100℃，保持10?min滅活，快速冷卻反應(yīng)液，然后采用離心機轉(zhuǎn)速5000?r/min，離心分離15-20?min，得到上層的酶解液。

（4）脫色脫腥

采用粉狀活性炭吸附脫色脫腥，在酶解液中加入質(zhì)量比為0.5-3%食品級粉狀活性炭，將水解液置于50℃的水浴鍋內(nèi)處理60?min，然后經(jīng)5000?r/min離心獲得上清液（即魚鱗蛋白酶解液）。

（5）魚鱗多肽超濾分離。