[發明專利]一種用于檢測免疫不育相關自身抗體的新型抗原

無效

• 申請號: 201110435317.4
• 申請日: 2011-12-22
• 公開（公告）號: CN103175952A
• 公開（公告）日: 2013-06-26
• 發明（設計）人: 蘭風華
• 申請（專利權）人: 蘭風華
• 主分類號: G01N33/531
• 分類號: G01N33/531
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

技術領域

??生殖免疫學包括生殖道粘膜免疫調節、生育免疫調節、母—胎免疫調節以及生殖內分泌—免疫調節4個方面。生殖免疫學認為人類的生殖腺與生殖細胞及其產生的激素都具有抗原性，可導致免疫反應，產生自身抗體，影響生殖過程的各個環節。正常人血清中有多種自身抗體，但其效價很低，不足以引起破壞作用，故稱之為“生理性抗體”；但當其效價明顯升高后，即引起自身免疫性疾病。1900年，Meichnikoff發現精子具有抗原性并能誘導特異性免疫應答的產生。1954年Wilson和Rumke首先在男性不育患者血清中發現了抗精子抗體（antisperm?antibody，AsAb）。1994年Marshburn等通過眾多研究提出：血清和生殖道內的AsAb可影響人類的生育能力。有研究指出：由AsAb引起的不育占總體不育者的10%-30%。然而精子抗原是一種復合性抗原，并非所有的抗精子抗體都與不育有關，只有那些針對在受精過程中起關鍵作用的精子靶抗原的抗精子抗體才有可能影響生育。精子上的與生育無關的無效抗原，可能會降低檢測敏感性及特異性，給病人的治療帶來不必要的麻煩。因此，分離純化精子特異性靶抗原作為包被抗原，是建立準確的檢測影響生育的抗精子抗體的方法。

背景技術

??免疫性不育，在臨床上通常是指排除器質性病變之外的“不明原因不育”的病因之一，對于免疫性不育的實驗室診斷，目前主要是針對抗精子抗體進行測定。采用的技術包括傳統抗原抗體反應、補體結合試驗、免疫熒光、免疫珠、酶聯免疫吸附法、混合抗球蛋白反應等，檢測的臨床標本包括血清、宮頸粘液、精漿等。然而，人類精子抗原相當復雜，約有100多種，按其特異性分為精子特異性抗原和精子非特異性抗原。它們所誘導產生的抗精子抗體對生育的影響力不盡相同。精子特異性乳酸脫氫酶（sperm-specific?lactate?dehydrogenase，LDH-C4）特異地存在于鳥類和哺乳動物的睪丸和精子中，可催化丙酮酸和乳酸的轉化，為精子的運動和存活提供能量，雌性動物和雄性動物的免疫系統均可將其識別為異已成份，作為自身抗原、異型抗原或同種異型抗原，誘導機體產生免疫應答反應。將純化的LDHC4蛋白、經化學修飾的LDHC4多肽或構建的LDHC4-DNA疫苗免疫實驗動物，在動物的血清或生殖道分泌液中均可檢測到特異性抗體的存在，且動物的生育率明顯降低，說明LDHC4抗體可能是抗精子抗體中與生殖密切有關的一種抗體。

發明內容

（一）目的

原核表達并純化制備重組人精子特異性乳酸脫氫酶（rhLDH-C4）抗原，并以此抗原為包被抗原，建立人血清抗LDH-C4抗體（IgG型）檢測的間接ELISA方法，為更準確的檢測免疫性不育患者體內的自身抗體建立一種可靠的方法。并探討人血清抗LDH-C4抗體與不育癥的具體關系。

（二）技術路線

1?pET-28(a+)-hLDHC重組載體的構建及鑒定

目的片段的擴增及回收：依據GenBank登錄的人LDH-C?mRNA（GI:187065）全長序列，采用OMIGA軟件，自行設計針對人LDH-C全長編碼序列兩端的引物，并委托上海博亞公司合成。P1（上游引物）：?5′-CCGAAGCTTGCACCAT

GTCAACTGTCAAGGAGCAGC-3′，帶一個Hind?Ⅲ酶切位點（劃線處）。P2（下游引物）序列為5′-CCGCTCGAGTTAAAATATTAGATCCTTT-