[發(fā)明專利]一種鴨病毒性肝炎自殺性DNA疫苗及其構(gòu)建方法和應(yīng)用

無(wú)效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201110433787.7
• 申請(qǐng)日: 2011-12-21
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN102580116A
• 公開(kāi)（公告）日: 2012-07-18
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 劉光清
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院上海獸醫(yī)研究所
• 主分類號(hào): A61K48/00
• 分類號(hào): A61K48/00;A61K39/29;A61P31/14;C12N15/51;C12N15/86
• 代理公司: 上海漢聲知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理有限公司 31236
• 代理人: 胡晶

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及動(dòng)物病毒學(xué)與動(dòng)物傳染病學(xué)的技術(shù)領(lǐng)域，特別涉及一種鴨病毒性肝炎自殺性DNA疫苗及其構(gòu)建方法和應(yīng)用。

背景技術(shù)

鴨病毒性肝炎(Duck?Viral?Hepatitis，DVH)是由鴨病毒性肝炎病毒(DHV)引起的雛鴨的一種高度致死、快速傳播的病毒性傳染病。該病的特征是發(fā)病急、病程短、死亡率高。臨床癥狀以痙攣、抽搐和角弓反張等神經(jīng)癥狀為主要特征，病理變化主要以肝臟腫大和斑點(diǎn)出血為特征性病變。DHV分為三個(gè)血清型，即I型、II型和III型，三個(gè)血清型之間無(wú)交叉保護(hù)作用。I型DHV呈世界性分布，并常和其它病毒、細(xì)菌混合感染，對(duì)養(yǎng)鴨業(yè)的危害很嚴(yán)重，給養(yǎng)鴨業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失，同時(shí)也是對(duì)養(yǎng)鴨業(yè)威脅最大的一種傳染病。DHV-I結(jié)構(gòu)蛋白為VP0、VP3、VP1構(gòu)型，其中，結(jié)構(gòu)蛋白中VP1位于衣殼表面，含有主要的抗原決定簇，包含了大多數(shù)能夠與細(xì)胞受體相互作用的抗原表位，能夠誘導(dǎo)宿主機(jī)體產(chǎn)生中和抗體，所以認(rèn)為VP1與DHV的致病性有密切的關(guān)系。經(jīng)試驗(yàn)證實(shí)，殼體蛋白含有多個(gè)β片層結(jié)構(gòu)，與其相連的環(huán)形結(jié)構(gòu)位于殼粒表面，這在免疫學(xué)中占有重要作用。

現(xiàn)有的DVH疫苗有DVH雞胚化弱毒苗、DVH雞胚化滅活苗和DVH鴨胚化滅活苗3種。通常認(rèn)為弱毒苗的免疫效果要好于滅活苗，但是存在毒力返強(qiáng)的危險(xiǎn)。與弱毒苗相比，滅活苗雖然安全，但是往往需要多次免疫接種，而且效果不穩(wěn)定，還經(jīng)常導(dǎo)致免疫失敗。

Berglund等于1998年率先提出了以甲病毒復(fù)制子為基礎(chǔ)的自殺性DNA疫苗(suicidal?DNA?vaccine)的設(shè)想，即利用自殺性DNA疫苗的甲病毒進(jìn)入細(xì)胞后能表達(dá)出甲病毒的非結(jié)構(gòu)蛋白(nSPs)，在nSPs的作用下，甲病毒基因組RNA進(jìn)行高效復(fù)制，在此過(guò)程中產(chǎn)生大量的雙鏈RNA(dsRNA)中間體，最終可使轉(zhuǎn)染的細(xì)胞凋亡，基于甲病毒復(fù)制子的DNA疫苗可引起轉(zhuǎn)染的細(xì)胞凋亡，也稱自殺性DNA疫苗，它比傳統(tǒng)DNA疫苗更安全，無(wú)整合到宿主染色體的潛在危險(xiǎn)性。自殺性DNA疫苗可引起高水平的體液免疫和細(xì)胞免疫，且可打破免疫耐受。在甲病毒基因組高效復(fù)制同時(shí)，目的抗原在亞基因組啟動(dòng)子的調(diào)控下獲得高效表達(dá)，從而可以較低的免疫劑量引起較強(qiáng)的免疫反應(yīng)。

自殺性DNA疫苗的載體是以甲病毒復(fù)制子為基礎(chǔ)的復(fù)制型DNA載體。病毒復(fù)制時(shí)結(jié)構(gòu)基因拷貝數(shù)高達(dá)10⁵之多，因此可以利用亞基因組的啟動(dòng)子使外源基因獲得高效表達(dá)。自殺性DNA疫苗由于其具有RNA復(fù)制子，大量復(fù)制可導(dǎo)致感染細(xì)胞的凋亡。該凋亡可能是復(fù)制型載體在表達(dá)外源基因的過(guò)程中產(chǎn)生雙鏈RNA(dsRNA)復(fù)制中間體介入的結(jié)果。dsRNA能在細(xì)胞和體液免疫中起強(qiáng)大的輔助作用。后來(lái)，研究者將RNA復(fù)制子載體系統(tǒng)改造成以DNA為基礎(chǔ)的、RNA聚合酶n依賴的系統(tǒng)。這種載體攜帶了甲病毒復(fù)制酶基因和外源基因的重組質(zhì)粒DNA，缺失了病毒結(jié)構(gòu)蛋白基因。它通過(guò)將人巨細(xì)胞病毒(CMV)早期增強(qiáng)子/啟動(dòng)子序列插入到SP6啟動(dòng)子的上游或替換SP6啟動(dòng)子啟動(dòng)轉(zhuǎn)錄。同時(shí)，在多克隆位點(diǎn)下游插入強(qiáng)轉(zhuǎn)錄終止信號(hào)SV40晚期聚A信號(hào)序列，正常終止轉(zhuǎn)錄。該質(zhì)粒DNA轉(zhuǎn)染宿主細(xì)胞后，利用宿主RNA聚合酶n在細(xì)胞核內(nèi)轉(zhuǎn)錄，合成甲病毒復(fù)制酶，再合成亞基因組RNA及大量外源蛋白，從而大大提高表達(dá)效率。因此，從自殺性DNA疫苗的構(gòu)建上我們可以看出其具有RNA疫苗和DNA疫苗的優(yōu)點(diǎn)，能自主復(fù)制、大量表達(dá)。

甲病毒復(fù)制子載體表達(dá)效率高，在理論上，在4h內(nèi)單個(gè)細(xì)胞內(nèi)可產(chǎn)生20萬(wàn)個(gè)RNA拷貝，表達(dá)的外源蛋白可占細(xì)胞總蛋白的25％。甲病毒復(fù)制酶可在多種細(xì)胞中發(fā)揮作用，如哺乳動(dòng)物細(xì)胞、禽類細(xì)胞、兩棲類動(dòng)物細(xì)胞和昆蟲(chóng)細(xì)胞等。RNA的復(fù)制在細(xì)胞漿內(nèi)進(jìn)行，是與宿主的復(fù)制系統(tǒng)分開(kāi)的。甲病毒復(fù)制子載體的高表達(dá)效率、廣泛的宿主細(xì)胞類型和獨(dú)立的細(xì)胞漿復(fù)制系統(tǒng)等特性，很適合作為DNA疫苗。該類載體轉(zhuǎn)染細(xì)胞后，其RNA復(fù)制酶可合成大量的雙鏈RNA(dsRNA)，而dsRNA可誘導(dǎo)轉(zhuǎn)染細(xì)胞凋亡，，因此稱為自殺性DNA疫苗。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的第一目的在于提供一種鴨病毒性肝炎自殺性DNA疫苗，以解決現(xiàn)有技術(shù)中現(xiàn)有的DVH疫苗一般為弱毒苗或滅活苗，弱毒苗存在毒力返強(qiáng)的危險(xiǎn)，而滅活苗往往需要多次免疫接種，而且效果不穩(wěn)定，還經(jīng)常導(dǎo)致免疫失敗的技術(shù)性問(wèn)題。

本發(fā)明的第二目的在于提供一種鴨病毒性肝炎自殺性DNA疫苗的構(gòu)建方法。

本發(fā)明的第三目的在于提供一種鴨病毒性肝炎自殺性DNA疫苗在制備預(yù)防和治療鴨病毒性肝炎藥物中的應(yīng)用。

本發(fā)明目的通過(guò)以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)：