[發明專利]含抗除草劑基因玉米葉綠體轉基因表達載體及其應用

無效

• 申請號: 201110433149.5
• 申請日: 2011-12-21
• 公開（公告）號: CN102533844A
• 公開（公告）日: 2012-07-04
• 發明（設計）人: 李軼女;張志芳;王金輝;王國增;程奇;倪丕沖;沈桂芳
• 申請（專利權）人: 中國農業科學院生物技術研究所
• 主分類號: C12N15/82
• 分類號: C12N15/82;C12N5/10;C12N15/66;A01H5/00
• 代理公司: 北京市德權律師事務所 11302
• 代理人: 余光軍

技術領域

本發明涉及一種葉綠體表達載體，尤其涉及一種含EPSP合酶(5-烯醇式丙酮莽草酸-3-磷酸合酶)基因玉米葉綠體表達載體及其構建方法，本發明還涉及該EPSP合酶基因玉米葉綠體表達載體在提高玉米草甘膦抗性中的應用，屬于玉米抗草甘膦轉基因工程領域。

背景技術

1988年Boynton等首次利用基因槍法將帶有atpB野生型基因的葉綠體DNA轟擊了atpB突變的衣藻，使其恢復了光合作用的能力，從而標志著葉綠體基因工程的開始。1900年首次利用基因槍法將rrn16基因在煙草葉綠體中得到表達，拉開了高等植物葉綠轉化的帷幕。水稻、玉米及小麥等禾本科植物是重要的糧食作物，但是葉綠體轉化技術在禾本科植物的應用進展卻很緩慢。2006年，Lee等首次將GFP和aadA基因成功重組到水稻(Oryza?sativa)葉綠體基因組中，為葉綠體轉化技術在禾本科植物中的應用奠定了基礎(Lee，S.M.，et?al.，Plastid?transformation?in?the?monocotyledonous?cereal?crop，rice(Oryza?sativa)and?transnmission?of?transgenes?to?their?progeny.Mol?Cells，2006.21(3)：401-410.)。李軼女等(李軼女等.水稻葉綠體表達體系的建立及抗PPT葉綠體轉化植株的獲得.中國農業科學，2007.40(9)：1849-1855.)選擇ndhF與trnL的基因間序列作為除草劑PPT抗性基因bar定點整合的位點，將bar基因重組到水稻葉綠體基因中，bar基因在水稻基因組中正常的表達，既提高了水稻抗PPT的能力，又可以作為轉化的篩選標記。Cui等利用基因槍法將GFP和npt?II基因轉化小麥未成熟盾片和花序，培養獲得了轉化植株，為葉綠體轉化技術成功的應用到禾本科植物培育新的品種奠定了基礎(Cui，C.，et?al.，Stable?chloroplast?transformation?of?immature?scutella?and?infiorescences?in?wheat(Triticum?aestivum?L.).Acta?Biochim?Biophys?Sin(Shanghai).43(4)：p.284-91.)。

葉綠體轉化的表達效率高且外源基因可以定點整合，顯花植物每個葉肉細胞含有約100個葉綠體，每個葉綠體含有約100個葉綠體基因組拷貝，如果完全同質化并有強啟動子存在，外源基因可以得到高效的表達，同時葉綠體對外源基因的表達有很強的承受能力。葉綠體可以直接表達來自原核的基因；葉綠體基因組具有原核性，葉綠體基因組多順反子轉錄、基因排列、調控方式、密碼子的偏愛性等與原核性很相似。葉綠體的原核性利于原核來源基因的表達。但是真核基因在葉綠體基因中也能很好的表達。多基因可以同時轉化，提高轉化效率；葉綠體基因組具有重疊基因，是以多順反子為轉錄單位，產生多順反子mRNA來合成蛋白質，所以由一個啟動子引導下的多個外源基因可以同時在葉綠體中表達，可實現多個基因的同時表達，多個外源基因可以同時進行表達，而不相互影響，避免因多個相同的啟動子調控多個基因在表達時產生基因沉默現象。葉綠體轉化沒有載體序列，位置效應和多效應；屬于母性遺傳，后代材料穩定；安全性高。葉綠體是母系遺傳，外源基因不會隨花粉傳播，造成基因漂移。

草甘膦是一種高效、廣譜、低殘留、低毒、易被微生物分解和內吸傳導的非選擇性的除草劑，被廣泛的應用于農業，其對大多數植物具有滅生性。由于草甘膦使用容易、高效、價格便宜，各國不斷增加草甘膦的生產量滿足日益增加的需求。轉基因的抗草甘膦作物大面積推廣給農民提供了草甘膦使用的新領域。1996年孟山都公司開發的抗草甘膦大豆GTS40-3-2首次銷售，到目前為止已經有超過1000個商業化的抗草甘膦大豆品種。

迄今為止，抗草甘膦的大豆、棉花、玉米、花生、煙草、甜菜等作物得到了推廣。2003年全世界抗草甘膦大豆種植面積大于0.41億hm²，其它抗除草劑的作物也大量的推廣，主要是抗草甘膦品種。從已經推廣的抗草甘膦作物來看，主要是美國的孟山都公司開發，轉入的基因是CP4EPSPS基因。孟山都將抗草甘膦作物種子與農達除草劑捆綁式銷售，已經形成了獨霸的局面。雖然從微生物、植物等克隆出了一些抗除草劑的EPSPS基因，也獲得了相應的轉基因植物，但是很少能達到推廣的水平。

目前中國國內還沒有出現廣泛推廣的抗草甘膦的新品種。