[發明專利]高青蒿素含量轉基因青蒿植株的生產方法

無效

• 申請號: 201110430810.7
• 申請日: 2011-12-20
• 公開（公告）號: CN102776212A
• 公開（公告）日: 2012-11-14
• 發明（設計）人: 唐克軒;陸續;張凌;沈乾;高爾娣;江偉民;張芳源;呂宗友
• 申請（專利權）人: 上海交通大學
• 主分類號: C12N15/52
• 分類號: C12N15/52;C12N15/82;C12Q1/68;A01H5/00;G01N30/02
• 代理公司: 上海漢聲知識產權代理有限公司 31236
• 代理人: 郭國中

技術領域

本發明涉及的是一種生物技術領域的提高青蒿素含量的方法，特別是涉及一種高青蒿素含量轉基因青蒿植株的生產方法。

背景技術

青蒿(Artemisia?annua?L.)是菊科蒿屬的一年生草本植物。青蒿素(artemisinin)是從其地上部分分離的一種含有過氧橋結構的倍半萜內酯化合物，是目前世界上公認的最有效的治療瘧疾的藥物，特別是對于腦型瘧疾和抗氯喹瘧疾具有速效和低毒的特點。目前，世界衛生組織推薦的最有效的治療瘧疾的方法就是青蒿素聯合療法(ACTs)。另外，隨著對青蒿素藥理研究的逐步深入，科學家發現青蒿素及其衍生物還具有抗炎、抗血吸蟲、抗腫瘤以及免疫調節的功能，可見青蒿素是一種極具潛力的天然藥物。

目前青蒿素的主要來源是從青蒿植株的地上部分提取，然而青蒿中青蒿素的含量非常低，使得這種藥物的大規模商業化生產受到了限制。由于青蒿素結構復雜，人工合成難度大，產量低，成本高，不具有可行性。有人嘗試用組織培養和細胞工程的方法來生產青蒿素，然而青蒿素在愈傷組織中含量低于干重的0.1％，在芽中最高也只有干重的0.16％，而大多數研究在根中沒有檢測到青蒿素。因此利用組織培養及細胞工程來生產青蒿素的可行性也不高。

經對現有技術文獻檢索發現，Pravej?Alam等在2011年的《Plant?Cell?Rep》(《植物細胞報道》)發表了題為“Over-expression?of?HMG-CoA?reductase?and?amorpha-4，11-dienesynthase?genes?in?Artemisia?annua?L.and?its?influence?on?artemisinin?content”(“在青蒿中過表達HMGR和ADS基因對青蒿素含量的影響”)的論文，報道通過共同轉化青蒿素合成途徑關鍵酶基因HMGR和ADS，得到的轉基因植株青蒿素含量得到明顯提高的轉基因株系。通過基因工程方法提高青蒿植株中青蒿素的含量為規模化生產青蒿素提供一條新途徑。

發明內容

本發明的目的在于克服現有技術中的不足，提供一種高青蒿素含量轉基因青蒿植株的生產方法。在非轉化普通青蒿含量為6.43mg/g?DW時，本發明得到的轉基因青蒿株系中青蒿素的含量最高達到15.09mg/g?DW，其含量是非轉化青蒿含量的2.35倍，本發明的方法對于為青蒿素的規模化生產提供高產、穩定新藥源具有重要意義。

本發明是通過以下的技術方案實現的，本發明涉及一種高青蒿素含量轉基因青蒿植株的生產方法，包括如下步驟：從青蒿中克隆ADS，CYP71AV1和CPR三個基因，構建含ADS，CYP71AV1和CPR三基因的植物表達載體，用根癌農桿菌介導，將ADS，CYP71AV1和CPR三基因轉入青蒿并再生出植株，篩選，獲得青蒿素含量提高的轉基因青蒿植株。

優選地，所述篩選包括如下步驟：PCR檢測外源目的基因ADS，CYP71AV1和CPR基因的整合情況，高效液相色譜法及蒸發光散射檢測器測定轉基因青蒿中青蒿素的含量。

優選地，所述PCR檢測為：設計合成35S和ADS，CYP71AV1和CPR基因的引物，進行DNA擴增，紫外線下觀察到目的條帶的株系即為轉基因青蒿植株。

優選地，所述高效液相色譜法及蒸發光散射檢測器測定青蒿植株中青蒿素含量，測定條件為：色譜柱C-18反相硅膠柱，流動相為甲醇∶水，甲醇∶水的體積比為70∶30，柱溫30℃，流速1.0mL/min，進樣量10μL，蒸發光散射檢測器漂移管溫度40℃，放大系數為7，載氣壓力5bar。

本發明具有如下的有益效果：本發明的共轉ADS，CYP71AV1和CPR三基因提高青蒿中青蒿素含量的方法，采用基因工程方法，將關鍵酶基因ADS，CYP71AV1和CPR三基因導入青蒿植株中，獲得了青蒿素含量顯著提高的轉基因青蒿株系，在非轉化普通青蒿含量為6.43mg/g?DW時，共轉ADS，CYP71AV1和CPR三基因青蒿中青蒿素的含量最高達到15.09mg/g?DW，其含量是非轉化青蒿含量的2.35倍，該發明對于為青蒿素的規模化生產提供高產、穩定新藥源具有重要意義。

附圖說明

圖1為植物雙元表達載體pCAMBIA2300-cyp71av1-cpr-ads的構建示意圖；

圖2為實施例中轉基因青蒿植株的PCR檢測結果圖；

圖3為實施例中青蒿植株中青蒿素的含量檢測結果圖。

具體實施方式