[發明專利]一種細腳擬青霉誘變菌株及其培育方法

有效

• 申請號: 201110427264.1
• 申請日: 2011-12-20
• 公開（公告）號: CN102533567A
• 公開（公告）日: 2012-07-04
• 發明（設計）人: 滕利榮;杜林娜;宋佳;逯家輝;孟慶繁;孟令軍
• 申請（專利權）人: 吉林大學
• 主分類號: C12N1/14
• 分類號: C12N1/14;C12N15/01;C12R1/79
• 代理公司: 吉林長春新紀元專利代理有限責任公司 22100
• 代理人: 陳宏偉

技術領域

本發明公開一種細腳擬青霉誘變菌株，為一種新的菌株品種，本發明還提供了該菌株的培育方法，屬于微生物技術領域。?

背景技術

細腳擬青霉Paecilomyces?tenuipes?(Peck)?Samson?是一種常見的昆蟲病原真菌，分類上隸屬于鱗翅目半知菌亞門，絲孢綱，擬青霉屬，為高雄山蟲草的無性型。以天然冬蟲夏草做對照分析表明，細腳擬青霉的主要化學組分如甾醇類、糖醇類、生物堿、有機酸類和微量元素與前者十分相似，所含氨基酸種類亦相同，但多種氨基酸含量卻高于冬蟲夏草。藥理作用方面研究表明細腳擬青霉具有抗腫瘤、抗菌、抗氧化和免疫調節功能，具有良好的藥用前景和開發價值。?

在本發明中，選育了一株細腳擬青霉優良菌株，其菌絲體內多糖、甘露醇和腺苷含量均較野生型細腳擬青霉有顯著提高，對其深入研究和廣泛應用具有重要意義。?

發明內容

本發明的目的在于提供一種細腳擬青霉誘變菌株，為一種新的菌株，其菌絲體內多糖、腺苷、甘露醇含量和野生菌相比有顯著提高。?

本發明還提供了該菌株的培育方法，適用于工業化生產。?

本發明的細腳擬青霉誘變菌株：在中國典型培養物保藏中心保藏，保藏地址：武漢武漢大學，保藏日期：2011年4月28日，分類名稱：細腳擬青霉N45?Paecilomyces?tenuipes?Samson?N45；保藏登記號為CCTCC?NO.M?2011145。?

本發明所述的細腳擬青霉菌株培育方法，包括以下步驟：

1）將細腳擬青霉原始菌株Paecilomyces?tenuipes?Samson?Pt196，接種于PDA斜面，24-26℃恒溫箱中培養3-7天，向斜面試管中注入無菌生理鹽水，振蕩后用無菌脫脂棉過濾，稀釋成濃度為3×10⁷個/mL的孢子懸液；

2）取制備得到的孢子懸液5mL，轉入滅菌包裝袋內進行高壓處理。在溫度26℃、壓力200M?Pa條件下處理30min后。?取高壓處理后孢子懸液于無菌蒸餾水中逐級稀釋，PDA培養基平板培養3-4天后，將菌株于96孔板保存；

3）利用平板初步篩選生長迅速的菌株；

4）將篩選獲得的菌株在搖瓶中復蘇，傳代后26℃，150rpm?恒溫搖床中培養4天，得菌絲體，測定菌絲體干重、多糖、甘露醇、以及腺苷含量，篩選高產的細腳擬青霉菌株。

5）獲得的高產細腳擬青霉誘變菌株經過連續傳代，培養條件為26℃，150rpm?恒溫搖床中培養96h，測定菌絲體干重、多糖、甘露醇、以及腺苷含量，考察誘變菌株的遺傳穩定性，從而最終確定目的菌株。?

本發明培養細腳擬青霉菌株的培養基，其特征在于是由以下藥物按重量份數比制成的：?

葡萄糖?40?g/L、?牛肉膏?10?g/L、大豆蛋白胨?10?g/L、?KH₂PO₄?0.688?g/L、?MgSO₄·7H₂O?1?g/L、NaCl?0.5?g/L、VB₁?0.201?g/L、VB₁₂?0.130?g/L；

本發明所述的細腳擬青霉誘變株的特征為：

1）細腳擬青霉誘變菌株菌絲體干重及腺苷、粗多糖和甘露醇四種有效成分的含量與原始菌株相比均有明顯提高，其中，菌體體干重達15.83g/L，較原出發菌提高了3.735％；腺苷含量可達0.054?g/L，較原出發菌提高了80％；多糖含量可達0.542?g/L，較原出發菌提高了44.15％；甘露醇含量可達2.019?g/L，較原出發菌提高了78.989％。

2）細腳擬青霉誘變菌株經過20次以上的連續傳代培養不退化，具有遺傳穩定性。?

本發明的積極效果在于：誘變的細腳擬青霉新菌株經10次以上傳代培養不退化，具有遺傳穩定性，并且胞內多糖、腺苷和甘露醇含量遠遠比原始菌高出許多倍。?

附圖說明

圖1、碳源對期望值的影響；?

圖2、氮源對期望值的影響；

圖3、無機鹽對期望值的影響；

圖4、各因素間的響應面及等高線圖；

圖5、隱含層節點數與Da相關圖；

圖6、遺傳代數與擬合值相關圖。

具體實施方法