[發(fā)明專利]馬動(dòng)脈炎病毒的液相芯片檢測(cè)引物及檢測(cè)方法

無效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201110426985.0
• 申請(qǐng)日: 2011-12-19
• 公開（公告）號(hào): CN102424865A
• 公開（公告）日: 2012-04-25
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 鄭小龍;徐彪;梁成珠;王群;朱來華;鄧明俊;岳志芹;肖西志;趙玉然
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 山東出入境檢驗(yàn)檢疫局檢驗(yàn)檢疫技術(shù)中心
• 主分類號(hào): C12Q1/70
• 分類號(hào): C12Q1/70;C12Q1/68;C12N15/11;C12R1/93
• 代理公司: 青島海昊知識(shí)產(chǎn)權(quán)事務(wù)所有限公司 37201
• 代理人: 張中南

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于動(dòng)物病毒檢測(cè)技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種馬動(dòng)脈炎病毒的液相芯片檢測(cè)引物及檢測(cè)方法。

背景技術(shù)

馬病毒性動(dòng)脈炎(Equine?Viral?Ateritis，EVA)是一種由馬病動(dòng)脈炎病毒(Equine?Ateritis?Virus，EAV)引起，在馬屬動(dòng)物之間通過呼吸道或生殖器官傳播的傳染病。馬匹感染EAV后大部分呈亞臨床感染，一部分成年馬的流感樣癥狀、懷孕母馬發(fā)生流產(chǎn)，新生馬駒發(fā)生間質(zhì)性肺炎。約有30％-60％種公馬感染EAV后持續(xù)帶毒，精液中的病毒可傳播給雌馬，引起EAV的傳播。該病在臨疹上表現(xiàn)為發(fā)熱、白細(xì)胞減少，常伴有眼瞼水腫和四肢浮腫，其特征性病理變化為小動(dòng)脈內(nèi)膜變性和壞死。

本病主要以美洲和歐洲為中心呈世界性分布，以小規(guī)模或中等規(guī)模的流行形式反復(fù)發(fā)生。澳大利亞雖然沒有臨床癥狀發(fā)生，但是通過對(duì)保存血清的檢查表明，1975年澳大利亞就有EAV抗體陽性馬。對(duì)1989-1992年收集的馬血清檢查結(jié)果表明，南非也有抗體陽性馬。1996年日本發(fā)現(xiàn)EAV抗體陽性的賽馬。1996年我國出口韓國的馬匹中也發(fā)現(xiàn)了EAV抗體陽性馬，但至今沒有從馬匹中分離到EAV。

近年來，由于賽馬業(yè)的發(fā)展和國外對(duì)食用馬的需求，進(jìn)出口馬病的檢測(cè)量不斷增加。國內(nèi)外研究者開發(fā)了多項(xiàng)馬病快速檢測(cè)診斷方法，如山東檢驗(yàn)檢疫局馬病實(shí)驗(yàn)室研究的ELISA、PCR檢測(cè)馬鼻肺炎和馬動(dòng)脈炎，固相基因芯片技術(shù)檢測(cè)五種馬病等這些方法基本上實(shí)現(xiàn)了快速檢測(cè)的需要。但是有些病還沒有成熟的檢測(cè)技術(shù)及試劑，如錐蟲病、焦蟲病等還需要用進(jìn)口檢測(cè)試劑。進(jìn)口試劑和試劑盒特別昂貴，且使用時(shí)必須提前2個(gè)月左右定貨，會(huì)嚴(yán)重影響檢測(cè)進(jìn)程。此外，現(xiàn)有的快速檢測(cè)方法中，ELISA、PCR等技術(shù)通量小，費(fèi)時(shí)費(fèi)力；固相芯片技術(shù)可以實(shí)現(xiàn)高通量檢測(cè)，但成本特別昂貴，無法在馬病檢測(cè)中應(yīng)用。迫切需要一種高通量、低成本、快速特異、靈敏可靠檢測(cè)方法。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的是提供馬動(dòng)脈炎病毒的液相芯片檢測(cè)引物及檢測(cè)方法，即一種操作簡(jiǎn)單、結(jié)果準(zhǔn)確的馬動(dòng)脈炎病毒液相芯片檢測(cè)方法，及其所用到的引物，從而彌補(bǔ)現(xiàn)有技術(shù)的不足。

本發(fā)明為實(shí)現(xiàn)上述目的，采用液相芯片技術(shù)。該技術(shù)是在核酸水平上的一種檢測(cè)技術(shù)，具有準(zhǔn)確性好、靈敏度高的特點(diǎn)。其原理是將編碼微球單個(gè)逐一通過檢測(cè)通道時(shí)受到雙色激光(如紅色和綠色)同時(shí)照射，第一束激光激發(fā)微球的分類熒光，根據(jù)熒光編碼確定微球的類別，即微球內(nèi)部的兩種熒光物質(zhì)受激發(fā)后可發(fā)射兩種不同波長的熒光，不同類別微球內(nèi)這兩種熒光物質(zhì)比例不同，則熒光強(qiáng)度比例也不同，從而將不同的特異性反應(yīng)區(qū)分開來；第二束激光激發(fā)報(bào)告分子上的熒光素，根據(jù)熒光強(qiáng)度確定微球上結(jié)合的報(bào)告分子的數(shù)量從而確定目標(biāo)分子的數(shù)量(定量)。系統(tǒng)只記錄與紅色熒光同時(shí)出現(xiàn)的綠色熒光信號(hào)，不記錄未結(jié)合的報(bào)告分子熒光信號(hào)，因此檢測(cè)前無需洗脫未結(jié)合的報(bào)告分子。此外，利用流式細(xì)胞術(shù)中90℃角散射光可有效地消除微球聚集對(duì)結(jié)果造成的影響。各種熒光信號(hào)經(jīng)分析軟件進(jìn)行數(shù)字化處理，可獲得檢測(cè)物的種類和數(shù)量。

本發(fā)明中所涉及到的引物和探針序列如下：

正向引物dirct?primer：5-CAACGGGTACACCGCAGTTGGT-3`?SEQ?ID?NO：1

反向引物reverse?pr?imer：5-CGGACCCGCATCTGACCAAACA-3`SEQ?ID?NO：2

探針Probe：5`-CGGCGGCGACAGCCTACA-3`SEQ?ID?NO：3。

正向引物和反向引物5’端進(jìn)行生物素標(biāo)記；探針的5’端進(jìn)行氨基化修飾。

本發(fā)明的引物和探針用于檢測(cè)馬動(dòng)脈炎病毒，其檢測(cè)方法包括有：1)檢測(cè)樣品RNA的提取、2)RT-PCR擴(kuò)增目的片段、3)寡核苷酸探針與微球共價(jià)偶聯(lián)、4)探針與RT-PCR擴(kuò)增片段雜交和5)液相芯片儀分析步驟。

其中步驟2)RT-PCR反應(yīng)的循環(huán)條件為：

第一階段，反轉(zhuǎn)錄50℃：30min；

第二階段，預(yù)變性94℃：3min；

第三階段，擴(kuò)增94℃：30s，59℃：30s，72℃：30s，30個(gè)循環(huán)；

第四階段，延伸72℃：5min。