[發(fā)明專利]一種雞IL-18與新城疫病毒HN基因重組融合蛋白及應(yīng)用

無效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201110426952.6
• 申請日: 2011-12-17
• 公開（公告）號: CN102676471A
• 公開（公告）日: 2012-09-19
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 張春杰;劉一塵;李靜;程相朝;吳庭才;李銀聚;王臣;張明亮
• 申請（專利權(quán)）人: 河南科技大學(xué)
• 主分類號: C12N9/24
• 分類號: C12N9/24;C12N15/62;C12N15/81;C12N1/19;A61K39/17;A61K39/39;A61P31/14;C12R1/84
• 代理公司: 鄭州睿信知識產(chǎn)權(quán)代理有限公司 41119
• 代理人: 牛愛周

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及一種雞白細(xì)胞介素-18(Interleukin-18，IL-18)與新城疫病毒HN融合蛋白及編碼該融合蛋白的DNA序列以及含該DNA序列的載體和酵母菌，還涉及重組融合蛋白及其應(yīng)用，屬于生物技術(shù)制藥工業(yè)中的基因工程生產(chǎn)疫苗和免疫佐劑的技術(shù)領(lǐng)域。

背景技術(shù)

新城疫(Newcastle?disease，ND)被國際獸疫局列為對動物危害最大的A類傳染病之一，它是由新城疫病毒(Newcastle?disease?virus，NDV)引起禽類的一種以呼吸困難、拉黃綠色稀便、神經(jīng)機能紊亂和粘膜、漿膜出血為主要特征的高度接觸性、急性敗血性傳染病；給養(yǎng)禽業(yè)造成了巨大經(jīng)濟損失。雞新城疫由于其發(fā)病率和死亡率都很高，是威脅養(yǎng)雞業(yè)的頭號疾病，對該病的控制成功與否直接決定了養(yǎng)禽業(yè)的發(fā)展趨勢。NDV的血凝素-神經(jīng)氨酸酶(hemagglutinin-neuraminidase，HN)基因編碼的HN蛋白在NDV致病過程中發(fā)揮著重要作用，是NDV除F糖蛋白之外另一種較大的糖蛋白，也是病毒的主要宿主保護性抗原，可誘導(dǎo)機體產(chǎn)生中和性抗體，在機體抗感染免疫中起著重要作用。因此，HN基因是NDV基因工程疫苗研究中的首選基因之一，用基因工程表達的HN蛋白具有良好的免疫原性，免疫雞后能產(chǎn)生較高水平的特異性抗體，對強毒攻擊有很好的保護作用。

在雞新城疫免疫預(yù)防中常規(guī)使用的疫苗主要有各種不同毒力的弱毒疫苗和油乳劑滅活疫苗。但傳統(tǒng)新城疫滅活疫苗的共同特性是能誘導(dǎo)強烈的體液免疫應(yīng)答，而細(xì)胞免疫反應(yīng)則相對軟弱。在新城疫的抗感染免疫中，抗體反應(yīng)對于機體抵抗病毒的感染是必需的，但不能阻止病毒的傳播。因而，近年來隨著分子生物學(xué)技術(shù)的飛速發(fā)展，NDV基因工程疫苗的研制已成為人們研究的熱點，但基因工程疫苗在誘導(dǎo)機體免疫反應(yīng)方面還存在一些不盡如人意之處，動物保護實驗效果不夠理想。因此，研究者試圖從多方面增強NDV疫苗的免疫效果，其中用細(xì)胞因子作為分子免疫佐劑，已引起研究者的關(guān)注。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的在于提供一種具有良好免疫效果的chIL-18-HN融合蛋白。

本發(fā)明的第二個目的是提供一種編碼該融合蛋白的DNA序列。

本發(fā)明的第三個目的是提供一種含該DNA序列的載體以及宿主細(xì)胞。

本發(fā)明的第四個目的是提供一種以畢赤酵母菌為宿主細(xì)胞的基因工程chIL-18-HN融合蛋白的制備方法。

另外，本發(fā)明的目的還在于提供一種該融合蛋白在雞新城疫防治中的應(yīng)用方法。

為了實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明的技術(shù)方案采用了一種chIL-18-HN融合蛋白，包括雞白細(xì)胞介素18(chIL-18)的氨基酸序列、新城疫病毒血凝素-神經(jīng)氨酸酶(HN蛋白)的氨基酸序列以及位于chIL-18氨基酸序列和新城疫病毒HN蛋白的氨基酸序列之間的柔性Linker肽氨基酸序列；由chIL-18基因和雞新城疫病毒HN基因通過柔性Linker肽(-G-G-S-G-G-S-G-G)串聯(lián)連接而成。

所述chIL-18-HN融合蛋白具有SEQ?ID?NO.7所示的氨基酸序列。

所述的柔性Linker肽具有SEQ?ID?NO.6所示的氨基酸序列。

同時，本發(fā)明的技術(shù)方案還采用了一種分離的DNA序列，編碼具有序列為SEQ?ID?NO.7所示的氨基酸序列的融合蛋白。

該DNA序列具有SEQ?ID?NO.5所示的核苷酸序列。

本發(fā)明的技術(shù)方案還采用了一種重組畢赤酵母載體和宿主細(xì)胞，它含有具有SEQ?ID?NO.5所示的核苷酸序列的DNA序列。

重組融合蛋白在雞新城疫預(yù)防和治療中的應(yīng)用。

具體地：本發(fā)明的chIL-18-HN融合蛋白及其DNA序列如下：

chIL-18-HN融合蛋白基因是由雞IL-18基因和雞新城疫病毒HN基因通過柔性Linker基因串聯(lián)連接而成，該串聯(lián)DNA序列所編碼的氨基酸序列即為chIL-18-HN融合蛋白。一方面，新城疫病毒HN蛋白能誘導(dǎo)機體產(chǎn)生高水平的特異性抗體，對強毒攻擊有很好的保護作用。同時，IL-18能誘導(dǎo)IFN-γ產(chǎn)生，刺激T、B淋巴細(xì)胞的增殖和分化，增強Th、細(xì)胞毒性T細(xì)胞和自然殺傷細(xì)胞等活性的功能，能特異性增強機體誘導(dǎo)細(xì)胞免疫和體液免疫的能力，在宿主防御、抗感染免疫等方面具有重要作用。二者通過柔性氨基酸肽連接，在保持獨立的空間結(jié)構(gòu)的同時能有效發(fā)揮各自的生物學(xué)功能。

本發(fā)明還采用了一種能高效表達chIL-18-HN融合蛋白的基因工程菌的構(gòu)建方法：