[發(fā)明專利]一種分離培養(yǎng)多種病毒的方法

無效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201110426494.6
• 申請日: 2011-12-18
• 公開（公告）號: CN103160476A
• 公開（公告）日: 2013-06-19
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 居麗雯;蔣露芳;汪千力;朱雯;姜慶五
• 申請（專利權(quán)）人: 復(fù)旦大學(xué)
• 主分類號: C12N7/00
• 分類號: C12N7/00;C12R1/93
• 代理公司: 上海元一成知識產(chǎn)權(quán)代理事務(wù)所(普通合伙) 31268
• 代理人: 吳桂琴

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬生物技術(shù)領(lǐng)域，涉及病毒的分離培養(yǎng)方法，具體涉及一種分離培養(yǎng)多種病毒的方法。尤其是用于分離培養(yǎng)多種病毒的MHV混合細(xì)胞液氮保存方法；該方法中包括凍存液的配方、液氮保存時(shí)間、經(jīng)液氮保存細(xì)胞復(fù)蘇的形態(tài)和分離培養(yǎng)主要呼吸道病毒、腸道病毒陽性分離率。

背景技術(shù)

現(xiàn)有技術(shù)公開了有關(guān)病毒性傳染病傳播速度快、范圍廣、社會危害影響大。近幾十年來，新的確認(rèn)的病毒性傳染病不斷出現(xiàn)，同時(shí)已被控制的一些傳染病又死灰復(fù)燃，人類與傳染病的斗爭形勢仍舊十分嚴(yán)峻。

對于傳染性疾病尤其是爆發(fā)疫情有效的鑒別診斷是公共衛(wèi)生應(yīng)急診斷的前沿技術(shù)，因此，及時(shí)準(zhǔn)確診斷感染病原體對社會民心的穩(wěn)定至關(guān)重要。有研究報(bào)道，采用MDCK細(xì)胞、HEp-2細(xì)胞和Vero細(xì)胞的三系混合細(xì)胞，可用于分離培養(yǎng)主要的呼吸道病毒如流感病毒、腺病毒、呼吸道合胞病毒等，人腸道病毒屬的腸道病毒EV71、CA16。

當(dāng)前，國內(nèi)采用混合細(xì)胞瓶分離培養(yǎng)多種病毒的研究較少，主要受制于實(shí)驗(yàn)條件和繁復(fù)操作；且有限的研究也僅限于二種或三種細(xì)胞計(jì)數(shù)制備后，直接用于多種病毒的分離培養(yǎng)。現(xiàn)有的病毒的分離培養(yǎng)方法遠(yuǎn)不能解決目前傳染性疾病爆發(fā)疫情的公共衛(wèi)生應(yīng)急的需求。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)的缺陷，提供一種分離培養(yǎng)多種病毒的方法，尤其是用于分離培養(yǎng)多種病毒的MHV混合細(xì)胞液氮保存方法；該方法包括凍存液的配方、液氮保存時(shí)間、經(jīng)液氮保存細(xì)胞復(fù)蘇的形態(tài)和分離培養(yǎng)主要呼吸道病毒、腸道病毒陽性分離率等，能為臨床病毒性疾病快速診斷、實(shí)驗(yàn)室病毒性傳染病監(jiān)測提供切實(shí)的可操作性的方法。

本發(fā)明方法中，采用MEM凍存液，通過T75細(xì)胞瓶制備混合細(xì)胞MHV單層細(xì)胞，單層細(xì)胞經(jīng)EDTA-胰酶消化，直接懸浮于冷凍保存液中，制成細(xì)胞數(shù)為1×10⁶/ml的冷凍保存液細(xì)胞懸液，所述的冷凍保存液保存MHV混合細(xì)胞，在液氮中保存4個月，細(xì)胞復(fù)蘇后存活率達(dá)到99.20％～99.60％。

本發(fā)明方法中，所述的保存的混合細(xì)胞MHV包括MDCK、HEp-2、Vero三種細(xì)胞，其中，每種細(xì)胞的細(xì)胞數(shù)為3.33×10⁵/ml，分裝NUNC冷凍保存管(型號：1.8ml/管)；混合細(xì)胞瓶在冷凍保存管中經(jīng)液氮保存4個月后復(fù)蘇，用于分離培養(yǎng)常見呼吸道病毒、腸道病毒。

本發(fā)明方法中，所述的MEM凍存液為含20％胎牛血清、8％DMSO的MEM培養(yǎng)液；

本發(fā)明方法中，選用的培養(yǎng)基為細(xì)胞培養(yǎng)常用培養(yǎng)基，培養(yǎng)條件在可控的溫度和CO₂濃度下。

本發(fā)明方法中，經(jīng)液氮保存4個月的MHV混合細(xì)胞復(fù)蘇后，倒置顯微鏡觀察細(xì)胞顯示其折光度好，經(jīng)37℃培養(yǎng)24h細(xì)胞形態(tài)良好；用于分離培養(yǎng)病毒，本發(fā)明的實(shí)施例中，分別用于對甲、乙型流感病毒、腺病毒、EV71病毒分離培養(yǎng)，結(jié)果顯示，分離培養(yǎng)結(jié)果滿意。

具體而言，本發(fā)明的一種分離培養(yǎng)多種病毒的方法，其特征在于，包括以下步驟：

(1)制備冷凍保存液：

胎牛血清(GIBCO，貨號8114318)6ml；DMSO(USEN)2.4ml；pH7.2MEM基礎(chǔ)培養(yǎng)液(GIBCO，貨號778445)21.6ml，分別加入至50ml無菌塑料管內(nèi)，制備成含20％胎牛血清、8％DMSO的MEM混合細(xì)胞凍存液；

(2)制備MHV混合細(xì)胞冷凍保存管：

將MDCK、HEp-2、Vero三株細(xì)胞系分別在T75細(xì)胞瓶中長成單層細(xì)胞后經(jīng)EDTA-胰酶消化，加入步驟(1)的冷凍保存液懸浮細(xì)胞，分別對MDCK、HEp-2、Vero細(xì)胞懸液計(jì)數(shù)后混合，制成細(xì)胞數(shù)為1×10⁶/ml的細(xì)胞懸液，其中，每株細(xì)胞的細(xì)胞數(shù)分別為3.33×10⁵/ml；將上述混合細(xì)胞懸液分裝至NUNC冷凍保存管，1.5ml/管；

(3)冷凍程序：

將上述1.5ml/管的冷凍保存管，置程序冷凍盒內(nèi)(Thermo)，然后將程序冷凍盒置入-80℃冰箱，經(jīng)24h冷凍后，取出凍存管，置入液氮罐抽屜中，液氮保存分別為1個月、2個月、3個月和4個月；

(4)液氮凍存的MHV細(xì)胞復(fù)蘇和計(jì)數(shù)：