[發明專利]一種分離培養多種病毒的方法

無效

• 申請號: 201110426494.6
• 申請日: 2011-12-18
• 公開（公告）號: CN103160476A
• 公開（公告）日: 2013-06-19
• 發明（設計）人: 居麗雯;蔣露芳;汪千力;朱雯;姜慶五
• 申請（專利權）人: 復旦大學
• 主分類號: C12N7/00
• 分類號: C12N7/00;C12R1/93
• 代理公司: 上海元一成知識產權代理事務所(普通合伙) 31268
• 代理人: 吳桂琴

1.一種分離培養多種病毒的方法，其特征在于，其包括步驟：

(1)制備冷凍保存液：

所述的冷凍保存液為含20％胎牛血清、8％DMSO的MEM混合細胞凍存液；

(2)制備MHV混合細胞冷凍保存管：

將MDCK、HEp-2、Vero三株細胞系分別在T75細胞瓶中長成單層細胞后經EDTA-胰酶消化，加入步驟(1)的冷凍保存液懸浮細胞，分別對所述的細胞懸液計數后混合，制成細胞數為1×10⁶/ml的細胞懸液，其中，每株細胞的細胞數分別為3.33×10⁵/ml；分裝至冷凍保存管；

(3)冷凍程序：

將上述冷凍保存管置程序冷凍盒內，入-80℃冰箱，冷凍24h后，凍存管置入液氮罐抽屜中，液氮保存不同時間；

(4)液氮凍存的MHV細胞復蘇和計數：

取上述凍存的MHV混合細胞管，37℃水浴溶解復蘇，低速離心，棄上清，用含5％胎牛血清MEM生長液重懸細胞沉淀，并吸入滅菌細胞瓶，染色后在顯微鏡下活細胞計數；

(5)制備MHV混合細胞板：

將上述復蘇的混合細胞懸液分裝24孔培養板中，置37℃、5％CO2溫箱中培養，24h、48h分別在倒置顯微鏡觀察MHV混合細胞匯合形態、鋪滿單層百分率；

(6)分離培養多種病毒

取步驟(5)的復蘇的MHV混合細胞制備的細胞培養板分離培養多種病毒。

2.按權利要求1所述的方法，其特征在于，所述的步驟(3)中的液氮保存時間分別為1個月、2個月、3個月和4個月。

3.按權利要求1所述的方法，其特征在于，所述的步驟(4)中的復蘇的MHV混合細胞的存活率為99.20％～99.60％，活細胞計數為1.24×10⁵/ml以上；

4.按權利要求1所述的方法，其特征在于，所述的步驟(6)中的細胞培養板的鋪滿單層百分率為80％的細胞單層。

5.按權利要求1所述的方法，其特征在于，所述的步驟(6)中的多種病毒選自呼吸道流感病毒、腺病毒和人腸道病毒EV71。