[發(fā)明專利]一種氣液接觸式卷煙全煙氣暴露下的細(xì)胞毒性檢測方法

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201110423501.7
• 申請(qǐng)日: 2011-12-16
• 公開（公告）號(hào): CN102495183A
• 公開（公告）日: 2012-06-13
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 米其利;夭建華;管瑩;李雪梅;周嵐;繆明明
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 云南煙草科學(xué)研究院
• 主分類號(hào): G01N33/00
• 分類號(hào): G01N33/00
• 代理公司: 昆明今威專利商標(biāo)代理有限公司 53115
• 代理人: 楊宏珍

技術(shù)領(lǐng)域：

本發(fā)明涉及一種氣液接觸式卷煙全煙氣暴露下的細(xì)胞毒性檢測方法，屬于卷煙煙氣安全性評(píng)價(jià)技術(shù)領(lǐng)域。

背景技術(shù)：

用于煙草毒理學(xué)評(píng)價(jià)的全煙氣暴露方法研究，由于其在模擬人體內(nèi)環(huán)境、能夠?qū)崿F(xiàn)多個(gè)相關(guān)檢測終點(diǎn)、在線即時(shí)檢測原始全煙氣等方面所具有的不可替代的優(yōu)勢，引起了世界各煙草公司和分析檢測實(shí)驗(yàn)室的廣泛關(guān)注，一些煙草公司已經(jīng)對(duì)該暴露方法進(jìn)行了深入系統(tǒng)的研究。

目前，有關(guān)卷煙全煙氣體外暴露下方法已有專利公開。公開專利1(申請(qǐng)?zhí)枺?00810230659.0)是一種卷煙主流煙氣的細(xì)胞毒性測試方法，主要的暴露裝置是細(xì)胞培養(yǎng)瓶，通過將經(jīng)潔凈空氣稀釋的卷煙主流煙氣導(dǎo)入細(xì)胞培養(yǎng)瓶內(nèi)進(jìn)行細(xì)胞的煙氣暴露，此暴露方式中煙氣和細(xì)胞并不完全處于氣液交界面處，會(huì)有部分煙氣留在培養(yǎng)液中并繼續(xù)和細(xì)胞接觸。公開專利2(申請(qǐng)?zhí)枺?01110025480.3)是一種卷煙全煙氣染毒的細(xì)胞毒性測試方法，主要的暴露裝置是插入式細(xì)胞培養(yǎng)皿，通過使培養(yǎng)的細(xì)胞處于煙氣和培養(yǎng)液的氣-液交界面以達(dá)到細(xì)胞與卷煙煙氣暴露的目的。這兩個(gè)專利涉及的方法均是將貼壁狀態(tài)的細(xì)胞處于氣-液交界面上，讓煙氣直接地部分或者完全接觸細(xì)胞以達(dá)到卷煙全煙氣暴露的目的。授權(quán)專利(專利號(hào)：201120063251.6)是一種用于卷煙全煙氣暴露的裝置，由其上設(shè)有煙氣出口的卷煙全煙氣暴露瓶及置于全煙氣暴露瓶中的煙氣導(dǎo)入管塞組成，其中煙氣導(dǎo)入管塞由煙氣入口、潔凈空氣入口、煙氣與空氣混合腔、稀釋后煙氣輸送通路構(gòu)成，通過不同流速的潔凈空氣稀釋達(dá)到煙氣暴露量的控制。該暴露裝置易與吸煙機(jī)連接。與上述第1和第2兩件專利中暴露裝置的氣液交界面處暴露原理不同的是，授權(quán)專利(專利號(hào)：ZL201120063251.6)的暴露裝置是基于氣液接觸原理而設(shè)計(jì)，使用的是處于懸浮狀態(tài)的細(xì)胞。

目前，關(guān)于卷煙全煙氣暴露的細(xì)胞毒性試驗(yàn)研究已有報(bào)道。但經(jīng)文獻(xiàn)檢索，未發(fā)現(xiàn)與本發(fā)明內(nèi)容相同文獻(xiàn)的公開報(bào)道。

參考文獻(xiàn)：

[1]Aufderheide?M，Mohr?U.Amodifiedsystem?for?the?direct?exposure?ofbacteria?to?inhalable?substances[J].Exp?Toxic?Pathol，2004，55：451-454.

[2]Aufderheide?M，Ritter?D，Knebel?JW，et?al.Amethod?for?in?vitro?analysisof?the?biological?activity?of?complex?mixtures?such?as?sidestream?cigarette?smoke[J].Exp?Toxic?Pathol，2001；53：141-152.

[3]盧斌斌，RyaN?M，Lynne?W，等.3種不同焦油卷煙煙氣的細(xì)胞毒性比較[J].煙草科技，2007，12：38-41.

發(fā)明內(nèi)容：

本發(fā)明的目的在于提供一種氣液接觸式卷煙全煙氣暴露下的細(xì)胞毒性檢測方法，為卷煙煙氣安全性評(píng)價(jià)提供技術(shù)支持。

本發(fā)明涉及的中國倉鼠卵巢細(xì)胞(Chinese?Hamster?Ovary?Cell，CHO細(xì)胞)為實(shí)驗(yàn)室常規(guī)實(shí)驗(yàn)用細(xì)胞，從國內(nèi)外的細(xì)胞保藏機(jī)構(gòu)購買得到。本發(fā)明使用的裝置為“一種用于卷煙全煙氣暴露的裝置ZL201120063251.6”。

本發(fā)明的目的通過下述技術(shù)步驟實(shí)現(xiàn)：

a.按常規(guī)方法傳代培養(yǎng)CHO細(xì)胞，并制備CHO細(xì)胞懸浮液，細(xì)胞濃度是(5-10)×10⁴個(gè)/mL，并將之分裝至ZL201120063251.6的全煙氣暴露瓶內(nèi)，10mL/瓶；

b.將全煙氣暴露瓶置于37℃恒溫水浴鍋內(nèi)，并和潔凈空氣瓶及直線型吸煙機(jī)連接；

c.在吸煙機(jī)控制面板上按照國標(biāo)GB/T?16450設(shè)定卷煙抽吸參數(shù)；

d.按c步驟設(shè)定的卷煙參數(shù)進(jìn)行卷煙的抽吸，再經(jīng)流速為0-1000mL/min的潔凈空氣稀釋的卷煙全煙氣的暴露，暴露時(shí)間均是5min；暴露完畢，取下全煙氣暴露瓶，進(jìn)行中性紅細(xì)胞毒性試驗(yàn)或MTT細(xì)胞毒性試驗(yàn)；

e.細(xì)胞毒性檢測：

(1)中性紅細(xì)胞毒性試驗(yàn)

將暴露完畢的細(xì)胞懸浮液轉(zhuǎn)移至離心管內(nèi)，1000rpm/min轉(zhuǎn)速下離心5-10min；移除上清液，加入新鮮的常規(guī)生長培養(yǎng)基10mL，制成細(xì)胞懸浮液，并將之接種至96孔細(xì)胞培養(yǎng)板內(nèi)，置于CO₂培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)24h，后按常規(guī)方法進(jìn)行中性紅細(xì)胞毒性試驗(yàn)；