[發(fā)明專利]含有增強子Hr3和啟動子IE1的轉(zhuǎn)基因干擾載體及其制備方法和應(yīng)用

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201110423286.0
• 申請日: 2011-12-16
• 公開（公告）號: CN102492711A
• 公開（公告）日: 2012-06-13
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 夏慶友;蔣亮;王根洪;程廷才;徐漢福
• 申請（專利權(quán)）人: 西南大學
• 主分類號: C12N15/63
• 分類號: C12N15/63;C12N15/113;C12N15/66
• 代理公司: 北京同恒源知識產(chǎn)權(quán)代理有限公司 11275
• 代理人: 趙榮之

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及生物基因領(lǐng)域，特別涉及家蠶的轉(zhuǎn)基因技術(shù)。

背景技術(shù)

家蠶是具有重要經(jīng)濟價值的鱗翅目昆蟲，在很多發(fā)展中國家，養(yǎng)蠶業(yè)是農(nóng)民經(jīng)濟收入的一個重要來源。但是，每當養(yǎng)蠶業(yè)遭遇病毒侵害時，蠶業(yè)生產(chǎn)必將受到不可挽回的巨大損失。家蠶核型多角體病毒（BmNPV）是對養(yǎng)蠶業(yè)危害最為嚴重的一種病原。已有研究結(jié)果表明，破壞病毒的某些必需基因，病毒將不能進行增殖。利用轉(zhuǎn)基因技術(shù)抑制病毒關(guān)鍵基因的表達是培育家蠶抗病品種的有效策略。

RNA干擾（RNAi）是指通過反義RNA和正鏈RNA形成雙鏈RNA（dsRNA）分子，在mRNA水平關(guān)閉相應(yīng)序列基因的表達或使其沉默，即序列特異性的轉(zhuǎn)錄后基因沉默技術(shù)。RNA干擾是最近十年發(fā)展起來的操控基因表達的新的強有力的實驗方法。因為RNA干擾技術(shù)利用了dsRNA?能夠特異的介導靶標基因表達沉默這一在生物界本身存在的基因表達調(diào)節(jié)機制，故與其他調(diào)控基因表達的手段相比，具有高效、快速且特異性好的特點。此外，由于RNA干擾是生物體固有的古老而天然的抗病毒機制，所以RNA干擾技術(shù)用于抗病毒治療是最直接的運用。

利用轉(zhuǎn)基因和RNA干擾相結(jié)合的轉(zhuǎn)基因干擾技術(shù)，構(gòu)建轉(zhuǎn)基因干擾載體，在轉(zhuǎn)基因家蠶體內(nèi)持續(xù)表達能夠抑制BmNPV病毒增殖的dsRNA，是制備家蠶抗病毒品種的有效方法。目前已有研究者利用IE1或者A4等組成型啟動子來構(gòu)建轉(zhuǎn)基因干擾載體，制備轉(zhuǎn)基因家蠶系統(tǒng)。但是，不管是否有病毒侵染，這些轉(zhuǎn)基因家蠶系統(tǒng)體內(nèi)都會有等量的dsRNA存在。因此，最優(yōu)的轉(zhuǎn)基因干擾載體應(yīng)該是，制備的轉(zhuǎn)基因家蠶在正常情況下有適量的dsRNA表達，在病毒侵染以后，家蠶體內(nèi)的dsRNA量隨著病毒侵入而誘導上調(diào)表達。

目前已經(jīng)報道的少量關(guān)于家蠶轉(zhuǎn)基因干擾抗BmNPV的研究中，都是利用組成性啟動子構(gòu)建轉(zhuǎn)基因干擾載體，通過注射實驗室用非滯育品種制備轉(zhuǎn)基因家蠶系統(tǒng)。目前還沒有利用組成誘導型啟動子構(gòu)建轉(zhuǎn)基因干擾載體，制備家蠶實用品種轉(zhuǎn)基因干擾系統(tǒng)的報道。

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發(fā)明內(nèi)容

?????本發(fā)明的目的之一在于提供增強子Hr3聯(lián)合啟動子IE1的應(yīng)用，該應(yīng)用為家蠶轉(zhuǎn)基因干擾載體的構(gòu)建提供了新思路。本發(fā)明的目的之二在于提供一種轉(zhuǎn)基因干擾載體，其能提高滯育家蠶品種對BmNPV病毒的抗性。本發(fā)明的目的之三在于提供上述轉(zhuǎn)基因干擾載體的制備方法，該方法操作簡單，穩(wěn)定性高。

本發(fā)明家蠶轉(zhuǎn)基因干擾載體的優(yōu)化方法及其應(yīng)用，依次通過以下步驟實現(xiàn)：?

(1)利用轉(zhuǎn)座載體pBac[3×P3-EGFPafm]構(gòu)建包含病毒IE1啟動子、gp64基因正向片段、家蠶肌動蛋白基因Actin?3內(nèi)含子、gp64基因反向片段和終止信號序列SV40片段的轉(zhuǎn)基因干擾載體pBac[IE1P-gp64S-A3intron-gp64A-SV40-3×P3-EGFPafm]?(pb-IGG)，包含家蠶A4啟動子、gp64基因正向片段、家蠶肌動蛋白Actin?3內(nèi)含子、gp64基因反向片段和終止信號序列SV40片段的轉(zhuǎn)基因干擾載體pBac[A4P-gp64S-A3intron-gp64A-SV40-3×P3-EGFPafm]?(pb-AGG)和包含病毒Hr3增強子、IE1啟動子、gp64基因正向片段、家蠶肌動蛋白Actin?3內(nèi)含子、gp64基因反向片段和終止信號序列SV40片段的轉(zhuǎn)基因干擾載體pBac[Hr3-IE1P-gp64S-A3intron-gp64A-SV40-3×P3-EGFPafm]?(pb-HIGG)。

(2)將家蠶932品種通過15℃低溫催青解除滯育，將產(chǎn)下的非滯育蠶卵收集好，在蠶卵產(chǎn)后2h-3h用顯微注射儀內(nèi)將3-4nl、總濃度為400ng/ul的混合質(zhì)粒（增量表達載體和輔助質(zhì)粒按1:1混合）注射進蠶卵，然后用無毒膠水將注射孔封住。

(3)將完成注射的蠶卵在35%的甲醛蒸汽中消毒4min后,置于25℃、相對濕度為80%的環(huán)境中進行催青直到孵化，將孵化的蟻蠶置于標準條件中飼養(yǎng)，將當代（G0）的蠶蛾進行自交或者回交，將滯育性的G1代蠶卵即時浸酸解除滯育，胚胎發(fā)育第六天在熒光顯微鏡下面篩選轉(zhuǎn)基因陽性個體，將獲得的轉(zhuǎn)基因個體單蛾區(qū)正常飼養(yǎng)，繼代擴大群體數(shù)量。

(4)將轉(zhuǎn)基因系統(tǒng)IGG、?HIGG、AGG和正常932（非轉(zhuǎn)基因932）經(jīng)口添食感染BmNPV病毒，設(shè)置不添食的轉(zhuǎn)基因和正常932對照，連續(xù)10天統(tǒng)計死亡率。不同劑量病毒添食后的死亡率統(tǒng)計結(jié)果顯示轉(zhuǎn)基因系統(tǒng)HIGG對BmNPV病毒的抗性效果最好。