[發明專利]含有增強子Hr3和啟動子IE1的轉基因干擾載體及其制備方法和應用

有效

• 申請號: 201110423286.0
• 申請日: 2011-12-16
• 公開（公告）號: CN102492711A
• 公開（公告）日: 2012-06-13
• 發明（設計）人: 夏慶友;蔣亮;王根洪;程廷才;徐漢福
• 申請（專利權）人: 西南大學
• 主分類號: C12N15/63
• 分類號: C12N15/63;C12N15/113;C12N15/66
• 代理公司: 北京同恒源知識產權代理有限公司 11275
• 代理人: 趙榮之

1.增強子Hr3和啟動子IE1在制備轉基因干擾載體中的聯合應用，所述增強子Hr3如SEQ?ID?NO:1的核苷酸序列所示，所述啟動子IE1如SEQ?ID?NO:2的核苷酸序列所示。

2.根據權利要求1所述的聯合應用，其特征在于：所述轉基因干擾載體為以BmNPV病毒為靶標的干擾載體。

3.含有增強子Hr3和啟動子IE1的轉基因干擾載體，其特征在于：所述轉基因干擾載體的基礎載體為轉座載體pBac[3×P3-EGFPafm]，所述基礎載體上依次含有增強子Hr3、啟動子IE1、目的基因正向片段、單鏈區、目的基因反向片段和終止信號序列SV40。

4.根據權利要求3所述的轉基因干擾載體，其特征在于：所述目的基因為gp64基因，gp64基因的正向片段如SEQ?ID?NO:3的核苷酸序列所示，gp64基因的反向片段如SEQ?ID?NO:4的核苷酸序列所示。

5.根據權利要求4所述的轉基因干擾載體，其特征在于：所述轉基因干擾載體為pBac[Hr3-IE1P-gp64S-A3intron-gp64A-SV40-3×P3-EGFPafm]，轉基因干擾載體以轉座載體pBac[3×P3-EGFPafm]為基礎載體，并依次含有病毒Hr3增強子、IE1啟動子、gp64基因正向片段、家蠶肌動蛋白基因Actin?3內含子、gp64基因反向片段和終止信號序列SV40片段。

6.?權利要求3所述的轉基因干擾載體的制備方法，其特征在于，具體包括以下步驟：

A．目的基因的正、反向片段的構建

設計目的基因正向片段，其上游引物為??5'?ccggaattcccgattaaacgtaaagtcgagcacc?3'，其下游引物為:??5'?cgcggatccgcggggcaataaacgaccaacc?3'；設計目的基因反向片段，其上游引物為:???5'?cccaagcttggggggcaataaacgaccaacc?3'，其下游引物為???5'?tgctctagagcaattaaacgtaaagtcgagcacc?3'；利用BmNPV病毒基因組為模板進行PCR擴增，分別得如SEQ?ID?NO:3所示的目的基因正向片段和如SEQ?ID?NO:4所示的目的基因反向片段；

B．pMD-19-gp64S-A3intron-gp64A的構建

將所述目的基因正向片段用EcoRⅠ和BamHⅠ進行雙酶切，同時用EcoRⅠ和BamHⅠ雙酶切包含A3?intron的pMD-19載體，連接酶切片段，得pMD-19-gp64S-A3intron載體；將所述目的基因反向片段和pMD-19-gp64S-A3intron載體分別用HindⅢ和XbaⅠ進行雙酶切并連接，得到pMD-19-gp64S-A3intron-gp64A載體；

C．1180-IE1P-gp64S-A3intron-gp64A-SV40載體的構建

將含有IE1啟動子和SV40終止信號的L4440載體和pMD-19-gp64S-A3intron-gp64A分別用EcoRⅠ和XbaⅠ進行雙酶切并連接，得L4440-IE1P-gp64S-A3intron-gp64A-SV40載體，其核苷酸序列如SEQ?ID?NO:5；將L4440-IE1P-gp64S-A3intron-gp64A-SV40和pSLfa1180fa載體分別用SalⅠ和BglⅡ進行雙酶切，回收目的條帶后連接轉化，篩選陽性克隆，得到1180-IE1P-gp64S-A3intron-gp64A-SV40載體；

D．1180-Hr3-IE1P-gp64S-A3intron-gp64A-SV40載體的構建

將1180-IE1P-gp64S-A3intron-gp64A-SV40載體和所述增強子Hr3分別用NcoⅠ進行單酶切，并連接，得1180-Hr3-IE1P-gp64S-A3intron-gp64A-SV40載體，其核苷酸序列如SEQ?ID?NO:6所示；

E．?pBac[Hr3-IE1P-gp64S-A3intron-gp64A-SV40-3×P3-EGFPafm]載體的構建

用限制性內切酶AscⅠ分別酶切步驟D所得1180-Hr3-IE1P-gp64S-A3intron-gp64A-SV40載體，得Hr3-IE1P-gp64S-A3intron-gp64A-SV40片段；同時用內切酶AscⅠ單酶切piggyBac[3×p3?EGFP?afm]，得piggyBac[3×p3?EGFP?afm]線性片段；將Hr3-IE1P-gp64S-A3intron-gp64A-SV40片段和piggyBac[3×p3?EGFP?afm]連接，得重組載體pBac[Hr3-IE1P-gp64S-A3intron-gp64A-SV40-3×P3-EGFP?afm]。